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Unraveling the mysteries of the plant cell wall: A characterization of three novel proteins related to cell wall signaling

Walden, John Brevoort

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Abstract

The field of plant cell wall signaling is one that has seen tremendous growth in the last few decades. One result of this has been the identification of many uncharacterized proteins putatively involved in the cell wall signaling network. This thesis outlines the initial characterization of three previously unstudied genes of interest in the model organism Arabidopsis thaliana which are loosely tied together by their apparent links, either directly or indirectly, with cell wall signaling. The first gene investigated, named PHYTOSULFOKINE LIKE 1 (PSKL1), is what seems to be a potential preproprotein with possible links to Phytosulfokine (PSK) singling and RECEPTOR-LIKE-PROTEIN 44 (RLP44). PSKL1 was found to contain two of the YIYTQ amino acid motifs found in PSK genes and to affect vascular cell identity. This was shown by an increase in the average number of metaxylem cells in the roots of pskl1 mutant seedlings, a phenotype that was rescued back to wildtype by exogenous PSK treatment. The inverse of this phenotypic trend was observed in a mutant line where both PSK motifs in the gene remained intact, suggesting that PSKL1 might function as more than a possible source of mature PSK’s. The second gene investigated is a member of the F-Box/RNI Like family. This gene was identified in a forward genetic screen looking for suppressors of the RLP44ox phenotype, where it emerged as the most likely candidate for a Brassinosteroid (BR) signaling independent RLP44ox suppressor. Generation of a f-box/rni like line in the RLP44ox background using the CRISPR/Cas9 system recapitulated the suppression phenotype, supporting its role as the causative mutant gene in the original forward genetic screen. Use of a F-Box/RNI Like:RFP line showed F-Box/RNI Like to be localized to the cytosol and a lack of colocalization with RLP44:GFP, suggesting that it doesn’t directly associate with RLP44. The third gene investigated is a receptor like protein named RECEPTOR-LIKE- PROTEIN 46 (RLP46), which has a high degree of genetic conservation throughout the plant kingdom. Available data showed highest RLP46 expression in mature root tissue, and a strong upregulation of expression upon exposure to the elicitor elf18, suggesting RLP46 might have a role in plant innate immune response. The CRISPR/Cas9 system was used to generate a rlp46 mutant line which was tested for biotic and abiotic stress phenotypes. rlp46 at first showed a possible NaCl resistance phenotype, but repetitions of the experiment gave conflicting results. There was however a subtle but consistent phenotype of resistance to elicitor induced growth inhibition in the rlp46 line. Co-immunoprecipitation and Western Blot showed evidence for an association between RLP46 and SUPPRESSOR-OF-BIR 1 (SOBIR1), providing a strong clue for how RLP46 might interact with the plant immune response signaling network. The experiments outlined in this thesis proved successful in characterizing these three proteins and provide a firm foundation for future research.

Translation of abstract (German)

Das Feld der Pflanzenzellwandsignale ist in den letzten Jahrzehnten enorm gewachsen. Das führte zur Identifizierung vieler bislang nicht charakterisierter Proteine, die mutmaßlich am Signalnetzwerk der Zellwand beteiligt sind. In dieser Dissertation werden drei bisher nicht untersuchte Gene des Modellorganismus Arabidopsis thaliana charakterisiert, die durch ihre scheinbar direkten oder indirekten Verbindungen mit der Signalübertragung an der Zellwand lose miteinander verbunden sind. Das erste hier untersuchte Gen, PHYTOSULFOKINE LIKE 1 (PSKL1), scheint ein potenzielles Preproprotein mit möglichen Verbindungen zu Phytosulfokine (PSK) -Einzelprodukten und RECEPTOR- LIKE-PROTEIN 44 (RLP44) zu sein. PSKL1 enthält zwei der in PSK-Genen gefundenen YIYTQ-Aminosäuremotive, was darauf schließen lässt, dass es die Identität der Gefäßzellen beeinflusst. Eine Zunahme der durchschnittlichen Anzahl von Metaxylemzellen in den Wurzeln von pskl1-mutierten Keimlingen, ein Phänotyp, der durch exogene PSK- Behandlung in den Wildtyp zurückgeführt wurde, bestätigt diese Vermutung. Die Umkehrung dieses phänotypischen Trends wurde in einer Mutante beobachtet, in der beide PSK Motive im Gen intakt blieben, was darauf hindeutet, dass PSKL1 zusätzlich zu seiner potentiellen Rolle als Quelle für reife PSKs noch weitere Funktionen haben könnte. Das zweite untersuchte Gen ist ein Mitglied der F-Box/RNI Like-Familie. Dieses Gen wurde in einem genetischen Vorwärtsscreening auf der Suche nach Suppressoren des RLP44ox- Phänotyps identifiziert, wobei es sich als wahrscheinlichster Kandidat für einen Brassinosteroid (BR)-Signal-unabhängigen RLP44ox-Suppressor erwies. Die Erzeugung einer f-Box/rni-like Linie im RLP44ox-Hintergrund unter Verwendung des CRISPR/Cas9- Systems immitierte den Suppressionsphänotyp und untermauerte seine Rolle als ursächliches mutiertes Gen im ursprünglichen genetischen Vorwärtsscreening. Die Verwendung einer F-Box/RNI-Like:RFP-Linie zeigte, dass F-Box/RNI-Like im Cytosol lokalisiert war und dass die Co-Lokalisierung mit RLP44:GFP fehlte, was darauf hindeutet, dass es nicht direkt mit RLP44 assoziiert. Das dritte untersuchte Gen ist RECEPTOR-LIKE- PROTEIN 46 (RLP46), ein Rezeptor-like Protein, das im gesamten Pflanzenreich einen hohen Grad an genetischer Konservierung aufweist. Die höchste RLP46-Expression wurde in reifem Wurzelgewebe gemessen, mit starker Hochregulierung der Expression bei Exposition gegenüber dem Elicitor elf18, was darauf hindeutet, dass RLP46 eine Rolle bei der angeborenen Immunantwort der Pflanze spielt. Das CRISPR/Cas9-System wurde verwendet, um eine rlp46-Mutantenlinie zu erzeugen, die auf biotische und abiotische Stressphänotypen getestet wurde. rlp46 zeigte zunächst einen möglichen NaCl-Resistenz- Phänotyp, aber Wiederholungen des Experiments ergaben widersprüchliche Ergebnisse. Es gab jedoch einen subtilen, aber konsistenten Phänotyp der Resistenz gegen durch Auslöser induzierte Wachstumshemmung in der rlp46-Linie. Co-Immunpräzipitation und Western Blot zeigten Hinweise auf eine Assoziation zwischen RLP46 und SUPPRESSOR-OF-BIR 1 (SOBIR1), was einen starken Hinweis darauf liefert, wie RLP46 mit dem Signalnetzwerk der pflanzlichen Immunantwort interagieren könnte. Diese Arbeit beschreibt die erfolgreiche Charakterisierung dieser drei Proteine, und bildet eine fundierte Basis für weitere Forschung.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wolf, Dr. Sebastian
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 4 May 2020
Date Deposited: 22 Jun 2020 12:58
Date: 2020
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
580 Botanical sciences
Uncontrolled Keywords: Cell Wall Signaling, Arabidopsis, Protein Characterization, Receptor Like Protein
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