German Title: Mathematische Modellierung von Wirtszell-Determinanten und Pharmakologische Intervention bei der Replikation des Hepatitis C-Virus

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Abstract

Hepatitis C virus (HCV) is a blood-borne, enveloped, single-stranded, (+)-oriented RNA virus that mainly infects hepatocytes. Most infections progress into chronicity and eventually lead to severe liver disease. Although effective treatments have been developed, access to diagnosis and treatment is low, particularly in non-developed countries. Thus, eradication of the disease is unlikely without a prophylactic vaccine. Research, therefore, has to continue despite the high cure rates of today’s HCV regimens. We use mathematical modeling to study HCV replication and its intricate connection with the infected host cell. A model that is able to simulate intracellular HCV RNA replication suggested a host factor species (HF), representing a protein (complex) or a host process, to be critically involved in HCV replication. Gene expression profiling revealed several candidates potentially representing this HF. We validated those candidates in two variants of the human hepatoma cell line Huh7 and could confirm that five of them indeed played a role for HCV replication, namely CRAMP1, LBHD1, CRYM, THAP7, and NR0B2. The latter three are nuclear receptors or transcriptional (co )repressors, suggesting they could influence HCV replication indirectly, e.g. through glucose, lipid, or cholesterol metabolism. Follow-up studies will help to understand the implication of those factors in HCV replication and reveal important insights into the metabolic pathways regulating HCV replication. Model analyses also revealed the most sensitive steps in HCV RNA replication that could potentially be targeted by specific intervention. The standard of care for chronic HCV infection has been interferon alpha (IFN α) therapy that elicited a very broad but rather unspecific antiviral response of the host cell and came along with severe side effects. IFN-α activates signaling cascades that lead to the expression of hundreds of interferon stimulated genes that exert antiviral action. Despite its decades-long use, the exact mechanism of the suppression of HCV replication by IFN α treatment remains elusive. We thus combined experimental data with an intracellular model for HCV replication and revealed the steps in the viral replication cycle that are most probably affected by IFN α treatment. The obtained findings were well in line with in vitro data and confirmed the validity of our intracellular model to make such analyses. Recently, direct-acting antivirals (DAAs) have replaced IFN-α-containing regimens as the standard of care for chronic HCV infection. Those DAAs possess much less side effects, can be taken orally, and give extraordinarily high cure rates. Mainly three classes exist: inhibitors of the viral protease, the viral polymerase, and a viral multifunctional phosphoprotein. The latter class constitutes highly potent inhibitors of the HCV NS5A protein, exerting effects in the low picomolar range. However, due to the many roles of NS5A in the HCV life cycle, the exact mechanism of action of those DAAs remains unclear. For the other two classes, the mode of action is distinct and well defined. We, thus, used one representative member of each of these classes to validate the capacity of our model to implement drug effects and predict HCV replication correctly. Model predictions upon a priori fixing of the affected parameters in the model qualitatively resembled HCV replication dynamics under the respective drug treatment. This allowed us to apply our model to HCV replication data under treatment with an NS5A inhibitor in order to gain insights into its mode of action. The model revealed that the translation rate of HCV RNA as well as RNA synthesis steps in the HCV replication compartment are most probably affected by the drug. These findings were reasonable and supported by known roles of NS5A in the HCV life cycle. However, our model was limited to intracellular HCV replication and did not account for steps like particle assembly or infection of target cells. Therefore, we extended our intracellular model to cover the full viral life cycle. Our new full life cycle model could simulate viral (+)- and (-)-strand RNA, viral titers as well as spread of the infection, and was able to correctly predict HCV replication under drug treatment. Our new model will be helpful in further elucidating the mode of action of NS5A inhibitors and IFN α and in deciphering the role of host factors that determine permissiveness for HCV. Hence, this study provides a novel, extended mathematical model of the full HCV life cycle with the proven capacity of simulating and analyzing HCV replication even under pharmacological intervention. It can serve as an invaluable tool to study further molecular details of HCV replication and to devise and test novel therapeutic approaches.

Translation of abstract (German)

Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein durch Blut übertragenes, umhülltes, einzelsträngiges, (+) orientiertes RNA-Virus, das hauptsächlich Hepatozyten infiziert. Die meisten Infektionen verlaufen chronisch und führen schließlich zu schweren Lebererkrankungen. Obwohl wirksame Therapien entwickelt wurden, sind die Diagnose- und Behandlungsraten niedrig, speziell in Entwicklungsländern. Daher ist eine Ausrottung der Krankheit ohne einen prophylaktischen Impfstoff unwahrscheinlich. Die Forschung muss daher, trotz der hohen Heilungsraten bei Therapie, fortgesetzt werden. Wir verwenden mathematische Modelle um die Replikation von HCV und seine komplexe Verbindung mit der infizierten Wirtszelle zu untersuchen. Ein solches Modell, das die intrazelluläre HCV-Replikation beschreibt, legte nahe, dass eine Wirtsfaktor-Spezies (WS), welche ein Protein, ein Proteinkomplex oder ein Wirtsprozess sein kann, entscheidend an der HCV-Replikation beteiligt ist. Die Erstellung von Genexpressionsprofilen ergab mehrere mögliche Kandidaten, die diese WS repräsentieren könnten. Wir validierten diese Kandidaten in zwei verschiedenen Varianten der menschlichen Hepatomzelllinie Huh7 und konnten bestätigen, dass fünf von ihnen tatsächlich eine Rolle für die HCV-Replikation spielten, nämlich CRAMP1, LBHD1, CRYM, THAP7 und NR0B2. Die letzteren drei sind nukleäre Rezeptoren oder transkriptionelle (Co-)Repressoren, was vermuten lässt, dass sie die HCV-Replikation indirekt beeinflussen, zum Beispiel durch den Glukose-, Lipid- oder den Cholesterinstoffwechsel. Folgestudien werden helfen, die Auswirkungen dieser Faktoren auf die HCV-Replikation zu verstehen und wichtige Einblicke in die Stoffwechselwege zu gewinnen, die die HCV-Replikation regulieren. Eine Modellanalyse zeigte auch die empfindlichsten Schritte in der intrazellulären HCV-Replikation auf, auf die eine spezifische Behandlung möglicherweise abzielen könnte. Die Standardbehandlung der chronischen HCV-Infektion war für lange Zeit die Interferon-alpha-(IFN α)Therapie, die eine sehr breite, aber eher unspezifische antivirale Reaktion der Wirtszelle auslöste und mit schweren Nebenwirkungen einherging. IFN-α aktiviert Signalkaskaden, die zur Expression von Hunderten von Interferon-stimulierten Genen führen, welche wiederum eine antivirale Wirkung entfalten. Trotz des jahrzehntelangen Einsatzes ist der genaue Wirkmechanismus von IFN-α auf die HCV-Replikation nicht genau bekannt. Wir kombinierten daher experimentelle Daten mit einem intrazellulären, mathematischen Modell der HCV-Replikation und zeigten die Schritte im viralen Replikationszyklus auf, die höchstwahrscheinlich durch eine IFN-α-Behandlung beeinflusst werden. Die erhaltenen Ergebnisse stimmen gut mit experimentellen Daten überein und bestätigen somit die Tauglichkeit unseres intrazellulären Modells für eine solche Art von Analysen. In den letzten Jahren haben spezifische, auf HCV gerichtete, antivirale Medikamente (DAAs) die IFN-α-basierte Standardtherapie für chronische HCV-Infektionen ersetzt. Diese DAAs zeigen weitaus weniger Nebenwirkungen, können in Tablettenform eingenommen werden und führen zu außerordentlich hohen Heilungsraten. Es gibt hauptsächlich drei Klassen dieser DAAs: Inhibitoren der viralen Protease, der viralen Polymerase und eines viralen multifunktionellen Phosphoproteins. Die letztere Klasse sind hochwirksame Inhibitoren des HCV NS5A-Proteins, die im niedrigen pikomolaren Bereich wirken. Aufgrund der vielen Rollen von NS5A im HCV-Replikationszyklus ist der genaue Wirkmechanismus dieser DAAs jedoch unklar. Für die beiden anderen Klassen ist der Wirkmechanismus allerdings eindeutig und gut definiert. Wir haben daher jeweils ein repräsentatives Mitglied dieser beiden Klassen verwendet, um die Fähigkeit unseres Modells zur Implementierung von Inhibitoreffekten und zur korrekten Vorhersage der HCV-Replikation während der Therapie zu validieren. Modellvorhersagen nach der a priori-Festlegung der betroffenen Parameter im Modell ähnelten qualitativ der HCV-Replikationsdynamik unter der jeweiligen Therapie. Dies ermöglichte uns die Anwendung unseres Modells auf HCV-Replikationsdaten unter der Behandlung mit einem NS5A-Inhibitor, um Einblicke in dessen Wirkmechanismus zu gewinnen. Das Modell zeigte, dass sowohl die Translationsrate der HCV RNA als auch die HCV RNA-Syntheseschritte im HCV-Replikationskompartiment höchstwahrscheinlich durch das Medikament beeinflusst werden. Diese Ergebnisse waren sinnvoll und wurden durch die bekannte Rolle von NS5A im HCV-Replikationszyklus unterstützt. Unser Modell beschränkte sich jedoch auf die intrazelluläre HCV-Replikation und berücksichtigte keine extrazellulären Schritte wie die HCV-Partikelproduktion oder die Infektion von Zielzellen. Daher erweiterten wir unser intrazelluläres Modell, um den gesamten viralen Replikationszyklus abzudecken. Unser neues Modell für den gesamten Replikationszyklus konnte virale (+)- und (-)-Strang-RNA, produzierte virale Partikel, sowie die Ausbreitung der Infektion simulieren und war zudem in der Lage, die HCV-Replikation unter medikamentöser Behandlung korrekt vorherzusagen. Unser neues Modell wird bei der weiteren Aufklärung der Wirkungsweise von NS5A-Inhibitoren und IFN-α sowie bei der Entschlüsselung der Rolle der WS, die die Permissivität für HCV bestimmt, hilfreich sein. Somit stellt diese Arbeit ein neuartiges, erweitertes mathematisches Modell des gesamten HCV-Replikationszyklus mit der geprüften Fähigkeit, die HCV-Replikation auch unter pharmakologischer Intervention zu simulieren und zu analysieren, bereit. Das Modell kann als sehr wertvolles Werkzeug dienen, um weitere molekulare Details der HCV-Replikation zu untersuchen und neue therapeutische Ansätze zu entwickeln und zu testen.