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Immunotherapy Development to Target Herpes Simplex Virus Infections

Seyfizadeh, Narges

German Title: Entwicklung einer Immuntherapie gegen Herpes Simplex-Virus Infektionen

[thumbnail of Narges seyfizadeh.thesis 9.30.2019.pdf] PDF, English
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Abstract

The clinical manifestation and pathogenesis of Herpes Simplex infections depend on at least the site of primary infection, age, immune status of the host and the type of HSV. The frequency and severity of infections usually decrease in the immunocompetent population with standard antiviral therapies (e.g. acyclovir/valacyclovir or penciclovir/famciclovir). However, there is a growing concern to induce selection of therapy-resistant HSV strains in immunocompromised patients, stem cell transplant recipients and HIV/HSV co-infected patients, which requires the development of novel anti-HSV therapeutics with different mechanisms of action. In addition, the result of conventional standard therapies is often neither long-lasting nor very effective. Antibody immunotherapy has been demonstrated to be efficacious for the treatment and prevention of viral infections. There is a convincing number of evidence showing the protective role of antibodies against herpes simplex virus (HSV) and amelioration of the severity of HSV-related diseases through neutralizing antibodies in in-vivo models. This may portend a promising future for antibody therapy of HSV infection. Given the fact that there is always a risk of HSV resistance development against a specific therapy, there is still a need to develop new monoclonal antibodies with better efficacies and longer protection. This project’s aim has been to develop fully human therapeutic IgGs targeting glycoprotein B of HSV as a novel therapy. Fully human gB-specific single chain Fvs (scFvs) have been previously selected from patient-specific antibody library repertoires that were generated from lymph nodes of head and neck cancer patients. The project aimed to analyse the potential of selected antibodies for future therapeutic interventions in patients with HSV infections. For this purpose, selected scFvs were reformatted into IgG type molecules and produced, followed by functional in-vitro as well as in-vivo characterization. Antigen specificity of antibodies against HSV-1/2 was analysed by using cell associated HSV glycoproteins (infected Vero cells). The EC50 for binding of H4 (H28) to HSV-1 F- and HSV-2 G- infected Vero cells was 8.5(6.7) nM and 10.9 (9.95) nM, respectively. The neutralization capability of cell-free virus and cell to cell transmission of the antibodies was investigated. Analysis by immunofluorescence microscopy confirmed that cell-to-cell spread was completely inhibited in the presence of gB (HSV) specific mAb H4 and HDIT101 (75μg/ml) and the infection was limited to the initial infection of single cells via virions in the inoculum. In contrast, IgG H28 did not show efficient plaque-reducing effects at any used concentration up to 75μg/ml, which corroborates the limited neutralization efficiency of cell-free virus with this antibody. With the purpose of finding the epitopes targeted by the investigated antibodies, antibody-resistant mutants were propagated in-vitro and the capability of the antibodies to bind to resistant mutants, to neutralize cell-free virus infection and to block virus transmission via cell-to-cell spread were investigated. Escape mutations against antibodies H4 and HDIT101 in HSV-1 conferred amino acid substitutions including R304Q in HDIT101-resistant HSV-1F and R335Q in H4-resistant HSV-1F. According to the data from competitive binding assays and amino acid substitution found in generated viral escape mutants, H4 and H28 bind to different epitopes of gB than HDIT101. In addition, R304Q and R335Q are defining critical amino acids of HDIT101 and H4 epitopes respectively. In addition, Fc effector functions (ADCC, CMC and ADCP) were characterized using infected Vero cells as well as HEK293T stably expressing gB. According to the results, the anti-gB specific antibodies H4, H28 and HDIT101 are all capable of mediating ADCP, while an activity in ADCC or CMC was not detected. Both gB (HSV)-specific mAbs H4 and HDIT101 neutralize HSV-1F/2G with similar efficacies regardless of presence or absence of complement. Conclusively, high affinity, specificity and high neutralization capacity of gB(HSV) specific mAbs (HDIT101, H4) in-vitro and in-vivo independent to Fc functions of antibodies make them potentially promising anti HSV therapies. The results of this thesis suggest the possibility to translate the identified fully human antibodies into a clinical therapy and hence likely provide a novel way to combat HSV infection.

Translation of abstract (German)

Die klinische Manifestation und Pathogenese von Herpes Simplex Virus (HSV) Infektionen hängt hauptsächlich von Faktoren wie dem primären Ort der Infektion, dem Alter und Immunstatus des Wirts sowie dem HSV Typ ab. In der Regel nimmt die Inzidenz und Schwere der Infektion bei immunkompetenten Populationen mit antiviralen Standardtherapien (z.B. Acyclovir/Valacyclovir oder Penciclovir/Famciclovir) ab. Allerdings werden bei immungeschwächten Patienten, Empfängern von Stammzell-Transplantationen und HIV/HSV Co-Infizierten, durch herkömmliche Therapien die mit zunehmender Dauer der Therapie resistente HSV Stämme zu induziert. Daher ist die Erforschung neuer anti-HSV Therapien, denen neue Wirkmechanismen zugrunde liegen, dringend nötig. Hinzu kommt, dass das Ergebnis konventioneller Standardtherapien oftmals weder lang anhaltend noch sehr effektiv ist. Antikörper Immuntherapien haben gezeigt, dass sie sowohl zur Behandlung als auch zur Vorbeugung viraler Infektionen geeignet sind. Vieles deutet darauf hin, dass neutralisierende Antikörper sowohl vor Herpes Simplex Viren schützen, als auch den Krankheitsverlauf in in vivo Experimenten verbessern. Dies verspricht eine potenzielle Zukunft der Antikörper als Therapie bei HSV Infektionen. In Anbetracht der Tatsache, dass stets die Möglichkeit einer HSV Resistenzbildung gegenüber einer bestimmten Therapie besteht, gibt es auch weiterhin Bedarf an neuen monoklonalen Antikörpern mit erhöhter Effektivität und längerem Schutz. Das Ziel dieser Arbeit war es, komplett humanisierte therapeutische IgGs gegen Glykoprotein B des HSV als neue Antikörper Therapie zu entwickeln. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden komplett humane gB-spezifische single chain Fv Fragmente (scFv) aus Antikörper Libraries, welche aus Lymphknoten von Kopf- und Nacken-Krebs Patienten generiert worden waren, selektiert. In diesem Projekt sollte das Potential einer Auswahl an Antikörpern als zukünftige Therapiemöglichkeit für Patienten mit HSV Infektionen getestet werden. Dazu wurden die ausgewählten scFv Fragmente in IgG Moleküle re-formatiert und produziert, um in Folge dessen durch funktionelle in vitro und in vivo Experimente charakterisiert zu werden. Die Antigen Spezifizität der Antikörper gegen HSV-1/2 wurde mittels Zell-assoziierter HSV-Glykoproteine (in Form infizierter Vero Zellen) bestimmt. Die EC50 Werte der Bindung von H4 und H28 an HSV-1 F- bzw. HSV-2 G-infizierte Vero Zellen betrug 8,5 und 6,7 nM (HSV-1 F) bzw. 10,9 und 9,95 nM (HSV-2 G), respektive. Darüber hinaus wurden die neutralisierenden Eigenschaften der Antikörper bezüglich freiem Virus und der viralen Zell-zu-Zell Transmission getestet. Hierbei ergab die Analyse mittels Immunfluorenszenz-Mikroskopie eine komplette Inhibition der Zell-zu-Zell Transmission für die gB (HSV) spezifischen monoklonalen Antikörper H4 und HDIT101 (bei 75μg/ml). Im Gegensatz zu IgG H4 zeigte IgG H28 für keine der getesteten Konzentrationen bis 75μg/ml eine effektive Reduktion von Plaques, was die limitierte neutralisierende Wirkung dieses Antikörpers auf freien Virus bestätigt. Um die Epitope der untersuchten Antikörper zu bestimmen, wurden Antikörper-resistente Mutanten in vitro gezüchtet und mit Hilfe dieser, die Antikörper auf ihre Bindungsfähigkeit an die Mutanten und ihre neutralisierende Wirkung in Bezug auf freien Virus sowie die Zell-zu-Zell Transmission hin untersucht. Die ausgebildeten Resistenzen des HSV-1 F gegen die Antikörper H4 und HDIT101 zeigten sich in Form von Mutationen der Aminosäuren R335Q im Fall des H4 Antikörpers und R304Q für HDIT101. Anhand der Daten aus kompetitiven Bindungs-Assays und den unterschiedlichen Aminosäure Substitutionen der resistenten Virus Stämme lässt sich schließen, dass H4 und H28 unterschiedliche Epitope auf gB besitzen, welche sich auch von den Epitopen des IgG HDIT101 unterscheiden. R304Q und R335Q stellen jeweils essentielle Aminosäuren der Epitope für HDIT101 bzw. H4 dar. Um die Antikörper weiter zu charakterisieren, wurde außerdem mit Hilfe infizierter Vero Zellen und stabil gB-exprimierender HEK293T Zellen die Fc Effektor Funktionen (ADCC, CMC und ADCP) getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass alle gB-spezifischen Antikörper H4, H28 und HDIT101 in der Lage sind, ADCP Aktivität zu induzieren, während ADCC oder CMC Aktivität nicht festgestellt werden konnten. Die beiden gB(HSV)-spezifischen monoklonalen Antikörper H4 und HDIT101 neutralisieren HSV-1F/2G mit vergleichbarer Effektivität und zudem unabhängig vom Komplementsystem. Somit lässt sich zusammenfassen, dass die hohe Affinität, Spezifität und eine hohe neutralisierende Wirkung der gB(HSV)-spezifischen monoklonalen Antikörper (HDIT, H4) in vitro und in vivo, diese als vielversprechende Kandidaten für eine HSV Therapie auszeichnen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für eine potenzielle Translation der charakterisierten vollhumanen Antikörper in die Klinik und somit für einen neuen Weg HSV Infektionen zu bekämpfen.

Document type: Dissertation
Supervisor: Krauss, Prof. Dr. med. Jürgen
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 29 June 2020
Date Deposited: 05 Aug 2021 12:11
Date: 2021
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Medizinische Universitäts-Klinik und Poliklinik
Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut für Immunologie
DDC-classification: 570 Life sciences
610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Immunology, Immunotherapy, Virology
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