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Polarization of a small GTPase at the plasma membrane of the root hair initiation domain

Schmidt, Vanessa Aphaia Fiona

German Title: Polarisierung einer kleinen GTPase an der Plasmamembran der Wurzelhaarinitiationsdomäne

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Abstract

Functional specialization of singles cells but also of whole tissues requires the division of labor and leads to the establishment of unequal distribution and polar organization. As a consequence, a diverse spectrum of cells with polar shapes has arisen in all kingdoms of life and conceptual similarities between these cells indicate the presence of a general unifying machinery. Even though we have a good understanding of the process of polar growth itself, we still know very little about the initial steps that lead to cellular asymmetry and polarity establishment. The root hair system of Arabidopsis thaliana is an excellent model to study all aspects of polarity and especially its initiation. One of the first proteins to localize at the root hair initiation domain (RHID) in Arabidopsis is the small GTPase RHO-OF PLANTS 2 (ROP2), which is a central regulator of the root hair growth machinery. ROP2 is a molecular switch that shuffles between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) state. It is obvious that the spatio-temporal control of ROP2 positioning and its activation is of critical importance for proper root hair development, however to date it remains unclear how ROP2 is recruited to the RHID, how ROP2 polarization is timed and how its polar accumulation is maintained. In this thesis I could show that the poly-basic region close to the C-terminus of ROP2 is necessary, but not sufficient for its accumulation at the RHID. I could further demonstrate that polar accumulation of ROP2 depends on its N-terminus, which we have reported to be involved in the interaction with its putative activator and landmark protein GEF3. I found that the ability to shuffle between its active and inactive state is critical for ROP2 polarization and have presented evidence for an activation-dependent immobilization of ROP2 that involves the interaction with GEF3, activation of GDP-ROP2 and differential protein mobility. Using single-molecule localization microscopy I was able to show that ROP2, GEF3 and other proteins of the root hair growth machinery localize into nanoclusters at the PM. To fully characterize the proteome of these nanoclusters, I established biotin-ligase based proximity labelling in Arabidopsis root hairs. This will allow us to elucidate whether the structuring of the PM (at the RHID) into nanoclusters plays a role in the establishment, maintenance and plasticity of cellular polarity.

Translation of abstract (German)

Die funktionelle Spezialisierung einzelner Zellen aber auch ganzer Gewebe erfordert Arbeitsteilung und führt zu Asymmetrie beziehungsweise polarer Organisation. Infolgedessen ist ein vielfältiges Spektrum polaren Zellformen entstanden und konzeptionelle Ähnlichkeiten zwischen diesen Zellen weisen auf das Vorhandensein einheitlicher Grundmechanismen hin. Obwohl wir den Prozess des polaren Wachstums an sich bereits gut verstehen, wissen wir immer noch sehr wenig über die ersten Schritte, die zur Ausbildung zellulärer Asymmetrie und Polarität führen. Die Wurzelhaare der Modelpflanze Arabidopsis thaliana sind ein hervorragendes System, um genau diese Aspekte zu untersuchen: Eines der ersten Proteine, das in der Wurzelhaar-Initiationsdomäne (RHID) von Arabidopsis akkumuliert ist die kleine GTPase RHO OF PLANTS 2 (ROP2), bei der es sich um einen zentralen Regulator der Wachstumsmaschinerie handelt. ROP2 ist ein molekularer Schalter, der zwischen einem aktiven (GTP-gebundenen) und einem inaktiven (GDP-gebundenen) Zustand wechselt. Welche Rolle genau der Aktivitätszustand des Proteins spielt und wie die positionsspezifische Rekrutierung von ROP2 reguliert wird, ist bislang noch unklar. Im Verlauf dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die poly-basische Region nahe dem C-Terminus von ROP2 notwendig, aber nicht ausreichend für seine Akkumulierung ist. Ich konnte weiterhin zeigen, dass die polare Akkumulierung von ROP2 von seinem N-Terminus abhängt, der an der Wechselwirkung mit dem mutmaßlichen Aktivator und Pionierfaktor GEF3 beteiligt ist. Ich fand heraus, dass die Fähigkeit zwischen dem aktiven und inaktiven Zustand zu wechseln für die ROP2-Polarisierung entscheidend ist und lege Beweise für eine aktivierungsabhängige Immobilisierung von ROP2 vor, welche die Wechselwirkung mit GEF3, die Aktivierung von GDP-ROP2 und Änderungen der Proteinmobilität beinhaltet. Mithilfe von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie konnte ich zeigen, dass ROP2, GEF3 und andere Proteine der Wachstumsmaschinerie an der Plasmamembran in Nanostrukturen zu finden sind. Zur weiteren Charakterisierung dieser Strukturen, habe ich eine Methode zur Markierung von Umgebungsproteinen in Wurzelhaaren von Arabidopsis etabliert. Wir werden somit in der Lage sein herauszufinden, ob die Strukturierung der Membran (an der RHID) eine Rolle bei der Etablierung, Aufrechterhaltung und Plastizität von Zellpolarität spielt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schumacher, Prof. Dr. Karin
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 1 December 2020
Date Deposited: 20 Jan 2021 13:12
Date: 2022
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
580 Botanical sciences

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  • Polarization of a small GTPase at the plasma membrane of the root hair initiation domain. (deposited 20 Jan 2021 13:12) [Currently Displayed]
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