German Title: Entwicklung eines automatisierten MALDI MS Assays zur direkten Analyse der Wirkstoffaufnahme über das Organische Anionen Transportierende Polypeptid OATP2B1

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Abstract

For the longest time, there was the widely held belief that drug uptake into a cell is mainly due to diffusion, channels and carriers. Only in the 1940s, there was the first drug-transporter interaction discovered. As more transporter-related diseases where discovered and transport proteins identified that had an important connection to cancer, like the breast cancer resistance protein, the research field gained more interest. Drug-Drug interactions were identified and an International Transporter Consortium was founded that had the task to identify relevant transport proteins and closely work together with the drug approval by the FDA. The majority of transport proteins either belong to the class of ABC transporters, which are primary active export transporters or to the class of solute carrier (SLC) transporters, which are secondary active uptake transporters. OATP2B1 is an organic anion transporting polypeptide and is part of the group of SLC transporters. It is seen as an emerging transport protein and has gained attention due to many drug-fruit juice interactions. As the simultaneous intake of fruit juices and drugs are likely to happen in everyday life and OATP2B1 is a human transporter expressed mostly in liver and intestine, it is important to understand more about its uptake mechanism and possible inhibition.

Until now, the emerging field of transporters are examined by either radioactive or fluorescence-based assays. Radioactive assays render a rather unpopular method with many obstacles like cost, safety-issues, labelling and no possibility of high-throughput. Fluorescence-based assays are widespread and have the positive property that they can be automated and used in HTS. The negative aspects here are also labelling and the false negatives and positives prediction that comes through autofluorescence and quenching effects. Our goal therefore was to develop an alternative cell based assay based on a different technology: MALDI MS. MALDI MS brings the advantage that it is a label-free technique and it also is HTS-compatible, like it was already shown in the past. Cell-based MALDI MS assays have gained recognition in the last years in consequence of their speed, robustness and ease in setup and are suitable for the investigation of transport mechanisms due to the abundance of additional information gathered by this technique.

For the MALDI MS method development, the use of E3S as a substrate provided the best results. The optimal matrix composition for the detection of E3S in the cells had to be found. 2.5 mg/mL Ph-CCA-NH2 in 70 % ACN were identified as the best composition and were further used for transport characterisation with the confirmation of time-dependence and concentration-dependence of E3S uptake. The optimal assay conditions (2 min, 10 µM E3S) were used to screen a set of 294 compounds consisting of the top 300 marketed drugs and a set of compounds that are known to interact with OATP2B1. The used compounds were tested in their ability to inhibit the uptake of E3S into the cells. There were 76 compounds found with an inhibition of more than 50 %, which were then further analysed by pIC50 determination. 67 of those compounds could be verified as hits, leading also to 14 very potent inhibitors with a pIC50 over 6. With an average CV % under 10 for 6 biological replicates, the method confirms reproducibility and reliability of the data.

As a reference assay to the aspired MALDI MS assay, also a fluorescence-based assay was developed to examine the uptake of DBF through OATP2B1. This assay was also used to screen the 294 compound set and 67 compounds with an inhibition ≥50 % were identified in the course of the experiments. 57 could be verified as a hit. There was a calculation being done to examine the clinical relevance of those transporters showing a clinical relevance of more than 60 % in the intestine reinforcing the meaning of transporter studies. By the comparison of the two techniques, it was found that only 47 inhibitors overlapped leading to compounds that were not found with one of both methods. This can eventually be explained by the use of different substrates and the multiple binding sites of OATP2B1, but still has to be addressed further. The comparison of the data with the previously published Karlgren et al. data set showed an overlap of 83 % and therefore shows the applicability of the MALDI MS method. To conclude, there were two assay systems developed that are suitable to examine the emerging transport protein OATP2B1. The importance of this transport protein has been shown through the amount of identified (clinically relevant) inhibitors. While the developed fluorescence-based method acts as a good reference method, the newly developed MALDI MS method represents a completely new way to analyse substrate and inhibitor of transporters. With its ease and speed in handling and most notably the label-free approach, the MALDI MS method is an indispensable tool for transporter characterisation and DDI analysis.

Translation of abstract (UNSPECIFIED)

Für eine lange Zeit war die generelle Meinung, dass Wirkstoffaufnahme in Zellen hauptsächlich durch Diffusion, Kanäle oder Carrier passiert. Erst in den 1940er Jahren wurde die erste Transporter-Wirkstoff Interaktion beobachtet. Durch die Entdeckung mehrerer Transporter-assoziierten Krankheiten und Verknüpfung mit Krebs, gewann dieser Forschungsbereich an Interesse. Arzneimittelwechselwirkungen wurden identifiziert und das Internationale Transporter Consortium gegründet, das die Aufgabe hat relevante Transportproteine zu identifizieren und eng mit der FDA im Hinblick auf Wirkstoff Zulassung zusammenzuarbeiten. Die größte Gruppe der Transportproteine gehört entweder zur Klasse der ABC Transporter, die primär aktive Transporter sind, oder zur SLC Gruppe, die sekundär aktive Transporter sind. OATP2B1 ist ein organische Anionen transportierendes Polypeptid und gehört zur Gruppe der SLC Transporter. Es wird als aufstrebendes Transportprotein bezeichnet und gewann Aufmerksamkeit durch viele Wirkstoff-Fruchtsaft Interaktionen. Durch die hohe Wahrscheinlichkeit gleichzeitig Fruchtsaft und Wirkstoffe aufzunehmen und die Expression von OATP2B1 in Leber und Darm, ist es wichtig mehr über den Aufnahmemechanismus und Inhibition zu verstehen.

Bisher wird das aufstrebende Feld der Transporter vor allem radioaktivbasiert oder fluoreszenzbasiert analysiert.Radioaktive Assays stellen eine eher unpopuläre Methode dar durch Hindernisse wie Kosten, Sicherheitsbedenken, Markierung und keiner Möglichkeit zu einem hohen Durchsatz. Fluoreszenzbasierte Assays sind weitverbreitet und haben die positive Eigenschaft, dass sie automatisiert werden können und im hohen Durchsatz stattfinden können. Der negative Aspekt ist hier, dass es eine markierte Technik ist und falsch negative und positive entstehen können durch Autofluoreszenz oder Quenching. Unser Ziel war deshalb einen alternativen zellbasierten Assay basierend auf einer anderen Technik zu entwickeln: MALDI MS. Diese Technik bringt den Vorteil, dass sie markierungsfrei ist und hochdurchsatzfähig. Zellbasierte MALDI MS Assays haben in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen durch die Schnelligkeit, Robustheit und Einfachheit in der Entwicklung und sind geeignet für die Untersuchung des Transportmechanismus.

Für die MALDI MS Methoden Entwicklung brachte die Benutzung von E3S als Substrat die besten Ergebnisse. Die optimale Matrix Zusammensetzung für die Detektion von E3S in Zellen musste gefunden werden. 2.5 mg/ml Ph-CCA-NH2 in 70% ACN wurden als beste Zusammensetzung identifiziert und genutzt für die Transporter Charakterisierung mit der Bestätigung der Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit der E3S Aufnahme. Die optimalen Assay Bedingungen (2 min, 10 µM) wurden genutzt um ein Set von 294 Substanzen zu screenen die sowohl die top 300 meistverkauften Substanzen des Jahres 2017 wie auch einige Wirkstoffe enthielt, die bekannterweise mit OATP2B1 interagieren. Die verwendeten Wirkstoffe wurden auf ihre Fähigkeit getestet die Aufnahme von E3S durch OATP2B1 zu inhibieren. 76 Wirkstoffe mit Inhibition über 50% wurden identifiziert und weiter charakterisiert durch pIC50 Bestimmung. 67 der Wirkstoffe konnten als Inhibitoren bestätigt werden unter denen auch 14 potente Inhibitoren (pIC50 >6) waren. Mit einem mittleren CV% unter 10 für 6 biologische Replikate ist die Reproduzierbarkeit der Methode bestätigt.

Als Referenzassay wurde auch ein fluoreszenzbasierter Assay aufgebaut, der Die Aufnahme von Dibromofluorescein durch OATP2B1 untersucht hat. Auch dieser Assay wurde für den Screen der 294 Substanzen benutzt und 67 Compounds mit Inhibition >50% identifiziert. 57 konnten als Hit bestätigt werden. Es wurde eine Berechnung durchgeführt um die klinische Relevanz der Inhibitoren zu untersuchen. Eine klinische Relevanz von mehr als 60% der Inhibitoren zeigte die Bedeutung der Studien. Durch den Vergleich der beiden Methoden wurde herausgefunden, dass nur 47 Hits überlappten. Das kann womöglich dadurch erklärt werden, dass unterschiedliche Substrate verwendet wurden und OATP2B1 multiple Bindungsstellen hat, was aber noch genauer untersucht werden muss. Der Vergleich der Daten mit dem kürzlich veröffentlichten Screen von Karlgren et. al. zeigte einen Überlapp von 83% und zeigt daher die Anwendbarkeit der MALDI Methode. Zusammenfassend wurden zwei Assay Methoden entwickelt, die sich eignen OATP2B1 zu untersuchen. Die Wichtigkeit dieses Transportproteins wurde durch die hohe Zahl an identifizierten (klinisch relevanten) Inhibitoren verdeutlicht. Während der entwickelte fluoreszenzbasierte Assay sich als gute Referenzmethode eignet, ist der neu entwickelte MALDI MS Assay eine ganz neue Art Substrat und Inhibitor zu analysieren. Durch die Einfachheit und Schnelligkeit und vor allem der markierungsfreien Eigenschaft ist die MALDI MS Methode ein unverzichtbares Werkzeug in der Transporter Charakterisierung und Analyse von Arzneimittelwechselwirkungen.