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Structural and functional characterization of conjugative transposition for the design of novel antibiotic resistance transfer inhibitors

Rojas Cordova, Carlos Alberto

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Abstract

Antibiotic resistance (ABR) is currently one of the most significant global health challenges. In addition to the rapid development of resistance against new antibiotics, the transfer of existing ABR genes between bacteria leads to the growth of difficult-to-treat multidrug-resistant opportunistic pathogens, causing millions of infections and thousands of deaths every year worldwide. Mobile genetic elements (MGEs) provide a powerful mechanism to transfer ABR genes, because they can move across bacterial cells and species and carry ABR cargos within their sequence. However, their mechanisms of transfer are incompletely understood. Therefore, I investigated the molecular mechanism of a prominent but poorly characterized MGE, the vancomycin resistance carrying conjugative transposon (CTn) Tn1549 from Enterococcus spp. This element is responsible for propagating resistance to this last-resort antibiotic in a wide range of intestinal bacteria. I focused my work on the integrase (Int) and excisionase (Xis) proteins, which are responsible for performing all DNA cleavage and joining reactions during Tn1549 transposition.

In the first part, I reconstituted the complex of Int with a four-way Holliday Junction (HJ) DNA molecule in vitro and solved its crystal structure at 3.3 Å resolution. This is the first CTn integrase structure trapped with this reaction intermediate, showing that these enzymes assemble a stable tetramer to recombine two DNA substrates, in a similar way as the site- specific tyrosine recombinases. Comparison of both enzyme families shows that a cyclic exchange of the C-terminal protein segments promotes tetramerization in all cases. I further characterized the structure of the accessory Xis protein at 1.5 Å resolution. In the second part of my work, I validated the structure by performing HJ resolution experiments in vitro. I found that Int can resolve HJ intermediates both to products and to substrates, likely due to missing regulatory factors. This reaction leads to DNA products containing up to 3 nt long unpaired regions, reflecting Int’s ability to insert its cargo DNA at diverse genomic sequences. In the third part of my work, I show that novobiocin, an aminocoumarin antibiotic, can inhibit Int tetramerization and HJ resolution in vitro, highlighting the importance of the tetrameric state for the transposition reaction.

This work sheds light on an essential step of Tn1549 transposition and its regulation. Moreover, it highlights crucial similarities with site-specific recombinases, increasing our understanding of conjugative transposition. As a proof-of-principle, inhibition of Int activity by novobiocin may open doors to develop potent CTn inhibitors as a new strategy to limit ABR spreading among bacteria.

Translation of abstract (German)

Antibiotikaresistenz (ABR) ist heutzutage eine der größten globalen Herausforderungen im Gesundheitswesen. Neben der raschen Entwicklung von Resistenzen gegen neue Antibiotika, der Transfer bestehender ABR-Gene zwischen Bakterien führt zum Wachstum multiresistenter opportunistischen Krankheitserreger, die schwer zu behandeln sind. Solche Erreger verursachen Millionen von Infektionen und führen zum Tod tausender Menschen jedes Jahr weltweit. Mobile genetische Elemente (MGEs) bieten einen leistungsfähigen Mechanismus zur Übertragung von ABR-Genen, da sie sich zwischen Bakterienzellen und unterschiedlichen Bakterienarten hinwegbewegen können und ABR-Ladungen in ihrer Sequenz tragen können. Diese Übertragungsmechanismen sind jedoch bis heute unvollständig verstanden. Aus diesem Grund untersuchte ich den molekularen Mechanismus eines prominenten, aber wenig charakterisierten MGE. Ein aus Enterokokken stammenden Konjugierenden Transposon (CTn) Tn1549, welches Vancomycin Resistenzgene in sich trägt. Dieses Element ist für die Ausbreitung der Resistenz gegen dieses Reserveantibiotikum in einer Vielzahl von Darmbakterien verantwortlich. Ich konzentrierte meine Arbeit auf die Proteine, Integrase (Int) und Excisionase (Xis), welche für die Durchführung aller DNA- Spaltungs- und Verbindungsreaktionen während der Tn1549 Transposition verantwortlich sind.

Im ersten Teil meiner Arbeit rekonstituierte ich einen Komplex, bestehend aus Int mit DNA, in ihrer „Holliday-Junction“ Struktur (HJ), in vitro und bestimmte seine Kristallstruktur bei 3.3 Å Auflösung. Dies ist die erste CTn-Integrase Struktur, welche in diesem Reaktionszwichenprodukt eingefangen wurde. Es zeigt, dass diese Enzyme einen stabilen Tetramer-Komplex zusammensetzen können, um zwei DNA-Substrate zu rekombinieren und dass diese Reaktion auf ähnlicher Weise wie bei den ortsspezifischen Tyrosin- Rekombinasen abläuft. Ein Vergleich beider Enzymfamilien zeigt, dass ein zyklischer Austausch der C-terminalen Proteinsegmente in allen Fällen die Tetramerisierung fördert. Ferner charakterisierte ich die Struktur des akzessorischen Xis-Proteins bei einer Auflösung von 1,5 Å.

Im zweiten Teil meiner Arbeit validierte ich die Struktur durch HJ-Auflösungsexperimente in vitro. Ich fand heraus, dass Int HJ-Zwischenprodukte sowohl zu Produkten als auch zu Substraten rekombinieren kann, wahrscheinlich aufgrund fehlender regulatorischer Faktoren. Diese Reaktion führt zu DNA-Produkten, die bis zu 3 nt lange ungepaarte Regionen enthalten, was die Fähigkeit von Int widerspiegelt, seine Fracht-DNA an verschiedenen genomischen Sequenzen zu integrieren.

Im dritten Teil meiner Arbeit zeige ich, dass Novobiocin, ein Aminocumarin-Antibiotikum, die Int-Tetramerisierung und die HJ-Auflösung in vitro hemmen kann, was die Bedeutung des Tetramer-Zustands für die Transpositionsreaktion hervorhebt.

Diese Arbeit beleuchtet einen wesentlichen Schritt der Tn1549-Transposition und ihrer Regulation. Darüber hinaus werden entscheidende Ähnlichkeiten mit ortsspezifischen Rekombinasen hervorgehoben, wodurch unser Verständnis der konjugierenden Transposition verbessert wird. Als Grundsatzbeweis kann die Hemmung der Int-Aktivität durch Novobiocin Türen öffnen, um wirksame CTn-Inhibitoren als neue Strategie zur Begrenzung der ABR-Ausbreitung unter Bakterien zu entwickeln.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Müller, Dr. Christoph W.
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 23 February 2021
Date Deposited: 31 Mar 2021 05:57
Date: 2022
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
Controlled Keywords: Transposon, Bakterien, Antibiotikum, Arzneimittelresistenz
Uncontrolled Keywords: Antibiotikaresistenz, Rekombination, Holliday Junction, Integrases
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