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Novel candidate intrinsic and extrinsic regulators of regeneration after axonal injury

Kampanis, Vasileios

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Abstract

Injured neurons in the peripheral nervous system (PNS) can regenerate long-distances and re-establish function, while in the central nervous system (CNS) they do not. Anatomical and cellular signaling discrepancies set up different post-traumatic landscapes between the PNS and CNS, therefore residing neurons respond distinctively to axonal injury. A clear example is when the lesioned peripheral branches of dorsal root ganglia (DRG) regenerate spontaneously, while the lesioned central branches do not. Understanding why such differences occur is the underlying theme of the work presented here. The regenerative capacity of the lesioned PNS is known to be transcription-dependent. Recently, the histone acetyl-transferase p300/CBP-associated factor (PCAF) was discovered to enhance the axonal regenerative program of the DRG as well as prime growth of injured central DRG axons. Although PCAF was found to be an essential player in the transcriptional regulation of a handful of key regeneration-associated genes (RAGs), the precise mechanism of how PCAF enhances axonal regeneration remained elusive. We identified PCAF-dependent RAGs (PCAF-RAGs) through analysis of the DRG transcriptome (RNA-seq) from wildtype and PCAF knockout mice after a peripheral regenerative lesion. Transcription factor binding site analysis predicted potential co-regulators, Specificity protein 1 (Sp1) and myc-associated zinc finger protein (MAZ). Knockdown and overexpression experiments showed that Sp1 and MAZ can enhance neurite outgrowth in vitro, dependent upon the presence of PCAF. More importantly, pharmaceutical activation of PCAF allowed for enhanced neurite outgrowth of cultured DRG and systemic administration of the PCAF activator promoted increased regeneration of the PNS. Anatomically, the periphery subjects its neurons to mechanical forces that may influence its repair outcome. These mechanical cues are missing from the CNS. Therefore, we explored if and how sensory neurons can respond regeneratively to mechanical stimulation. An in-house built bioreactor applied cyclic mechanical tension to PNS- or CNS-located DRG-nerve explants. Neurite length analysis showed that stretch can induce outgrowth of medium to large diameter DRG, partially through the expression of activating transcription factor 3 (ATF3). Our work shows that either a regenerative injury or mechanical stimulation regulate specific outgrowth-related transcriptional machinery. Better understanding of such mechanisms will allow recapitulation of regenerative programs in non-regenerating neuronal populations, in hopes of promoting functional regeneration and recovery.

Translation of abstract (German)

Während Neurone des peripheren Nervensystems (PNS) nach Verletzungen über weite Distanzen hinweg regenerieren und dadurch verlorene neurologische Funktionen wiederherstellen können, sind Neurone des zentralen Nervensystems (ZNS) dazu nicht in der Lage. Diese Diskrepanz ist durch Unterschiede der Anatomie sowie zellulärer Signalwege zwischen PNS und ZNS bedingt, wodurch ein unterschiedliches molekulares Milieu erzeugt wird, welches zu differenten Wachstumsreaktionen von Neuronen des PNS und ZNS führt. Als ideales Beispiel hierfür dienen Neurone der dorsalen Wurzelganglien (dorsal root ganglion, DRG): während das periphere DRG-Axon nach Verletzung regeneriert, ist das zentrale Axon des gleichen Neurons dazu nicht in der Lage. Das Regenerationsverhalten von Neuronen der DRG ist bedingt durch deren Gentranskription. Die Histon-Acetyltransferase PCAF (p300/CBP-associated factor) wurde hierbei als wichtiger molekularer Schalter für die Regenerationsfähigkeit von DRG-Neuronen identifiziert. Mit Hilfe von PCAF wird ein genetisches Regenerationsprogramm reguliert, welches regeneratives Wachstum des peripheren DRG-Axons initiiert und das zentrale DRG-Axon zum Wachstum befähigt. Weiterhin ist das PNS aufgrund seiner Anatomie äußeren mechanischen Kräften ausgesetzt, welche dessen Wachstumsfähigkeit beeinflussen. Im Gegensatz dazu sind Neurone des ZNS diesen mechanischen Kräften nicht ausgesetzt und es ist bisher unklar, ob das ZNS ebenfalls mit Wachstum auf mechanische Stimulation reagieren kann. Die Untersuchung der Reaktion des ZNS auf mechanische Stimulation sowie die Aufklärung der molekularen Grundlagen sind folglich von großem Interesse für die regenerative Medizin. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher, intrinsische Regeneration-assoziierte Unterschiede zwischen ZNS und PNS zu untersuchen. Die Expression von Regenerations-assoziierten Genen (RAG) kann durch epigenetische Mechanismen reguliert und nach einer Verletzung zu axonaler Regeneration führen. Obwohl PCAF essentiell für die Expression einiger RAGs ist, sind der exakte molekulare Signalweg sowie die Frage, wie PCAF Axonwachstum beeinflusst bisher nur unvollständig untersucht. Mit Hilfe von Transkriptionsanalysen (RNAseq) an Wildtyp- sowie transgenen PCAF-knock out-Mäusen wurden RAGs identifiziert, welche spezifisch von PCAF nach einer Verletzung des peripheren DRG-Axons reguliert werden. Zusätzlich wurden potenzielle Transkriptionsfaktor Bindestellen spezifisch für Specificity protein 1 (Sp1) sowie mycassociated zinc finger protein (MAZ) in den PCAF-regulierten RAGs identifiziert. In vitro-Studien basierend auf Knock down sowie Überexpression von Sp1 oder MAZ zeigten, dass beide Faktoren im Zusammenspiel mit PCAF Neuritenwachstum in kultivierten DRG-Neuronen verstärken können. Des Weiteren konnte dieses PCAF-abhängige Regenerationprogramm pharmakologisch ohne vorhergehende Verletzung des PNS oder virale Überexpression der einzelnen molekularen Komponenten nachgebildet werden. Zudem wurde der Effekt von mechanischer Stimulation auf die Regenerationsfähigkeit von sensorischen Axonen untersucht. Mit Hilfe eines speziell angefertigten Bioreaktors konnten definierte mechanische Impulse in Form von zyklischer mechanischer Streckung an DRG-Nerven Explantate appliziert werden. Durch anschließende Analyse des Neuritenwachstums konnte nachgewiesen werden, dass die zyklische mechanische Streckung das Wachstum von DRG-Neuronen mit mittlerem und großen Zelldurchmesser verbessert, partiell durch die verstärkte Expression von Activating Transcription Factor 3 (ATF3) in diesen Neuronen. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der intrinsischen Regenerationsfähigkeit des PNS kann folglich dazu dienen, die verminderte Regenerationsfähigkeit des ZNS zu beeinflussen, wodurch letztlich axonale Regeneration nach Verletzungen des ZNS erreicht werden kann.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Puttagunta, Dr. rer. nat. Radhika
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 23 February 2021
Date Deposited: 15 Mar 2021 07:28
Date: 2022
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Neurobiology, Regeneration
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