German Title: Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die an der Biosynthese und Modifikation von Stilbenen in Vitis vinifera beteiligt sind

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Abstract

Stilbenes are plant secondary metabolites from the polyphenols group found in 72 unrelated plant species. Among those plants is Vitis vinifera, an important crop plant in wine regions all across the world. The natural functions of stilbenes include the reaction to stress factors like UV-radiation and mechanical injury or defense reactions against bacterial, fungal or other pathogens. One of the most problematic pathogens in the wine regions in Germany is Plasmopara viticola, causing downy mildew, which leads to great crop losses. Aside from that, stilbenes have gotten attention in the recent years for their potent health beneficial properties. A multitude of studies, mainly pre-clinical trials, have indicated that stilbenes can delay aging parameters, help in the prevention of diseases including cancer or diabetes and are effective against cardiovascular diseases. While much attention is given to the functions of stilbenes, both in planta and in the medical or nutritional supplement areas, and the structures and occurrences of stilbenes are mostly known, the biosynthetic pathway leading to this wide variety of modified stilbenes remains largely unknown. The precursors of the stilbenes derive from the phenylpropanoid pathway, where the stilbene synthase, as first dedicated enzyme of the pathway produces trans-resveratrol. Apart from that, only one other enzyme, a resveratrol-O-methyl transferase and the two transcription factors (TFs) VvMYB14 and VvMYB15 are known and characterized. Other enzymes, for example for glycosylation, polymerization or other modification reactions remain yet to be found, as do dedicated transport proteins. Different V. vinifera tissues overexpressing VvMYB15, one of the two TFs that were shown to be important regulators of the stilbene biosynthesis pathway, were used to run two microarrays prior to this project. From this database, candidate genes with potentially important predicted functions were identified by their upregulation. The selected genes were then filtered by the means of in silico analysis and promoter induction assays before the correlation of their gene expression with the content of modified stilbenes, expected to be produced by their reaction, was investigated. This was done in V. vinifera berries of different developmental stages as well as leaf discs infected with P. viticola and allowed for the closer connection of several candidate genes with their expected products, while also giving valuable insight into the potential role of the stilbenes, and thus the genes, during development or in a defense against infection. In the last part of this thesis, the most promising candidate genes, three glycosyltransferases and a laccase, underwent closer biochemical characterization by expression in bacteria, yeast or tobacco and subsequent enzymatic assay or direct HPLC or UHPLC/MS analysis. While the full characterization of the candidate genes remains to be completed, promising results for the glycosyltransferases were obtained concerning the metabolization of resveratrol and other substrates and for the involvement of the laccase and viniferin in defense reactions.

Translation of abstract (German)

Stilbene sind pflanzliche Sekundärmetabolite aus der Gruppe der Polyphenole, die in 72 nicht verwandten Pflanzenarten vorkommen. Zu diesen Pflanzen gehört auch Vitis vinifera, eine wichtige Kulturpflanze in Weinregionen auf der ganzen Welt. Zu den natürlichen Funktionen der Stilbene gehören die Reaktion auf Stressfaktoren wie UV-Strahlung und mechanische Verletzungen oder Abwehrreaktionen gegen bakterielle, pilzliche oder andere Krankheitserreger. Einer der problematischsten Erreger in den deutschen Weinregionen ist Plasmopara viticola, der Falsche Mehltau, der zu großen Ernteausfällen führt. Abgesehen davon haben Stilbene in den letzten Jahren wegen ihrer potenten gesundheitsfördernden Eigenschaften Aufmerksamkeit erregt. Eine Vielzahl von Studien, vor allem präklinische Versuche, haben darauf hingewiesen, dass Stilbene Alterungsparameter verzögern können, bei der Vorbeugung von Krankheiten wie Krebs oder Diabetes helfen und gegen Herz-Kreislauf-Erkrankungen wirksam sind. Während den Funktionen der Stilbene sowohl in planta als auch im Bereich der Medizin oder der Nahrungsergänzung viel Aufmerksamkeit geschenkt wird und die Strukturen und Vorkommen der Stilbene weitgehend bekannt sind, ist der Biosyntheseweg, der zu dieser großen Vielfalt an modifizierten Stilbenen führt, noch weitgehend unbekannt. Die Vorstufen der Stilbene entstammen dem Phenylpropanoidsyntheseweg, wobei die Stilbensynthase als erstes dediziertes Enzym des Weges trans-Resveratrol produziert. Daneben sind nur ein weiteres Enzym, eine Resveratrol-O-Methyl-Transferase und die beiden Transkriptionsfaktoren (TFs) VvMYB14 und VvMYB15 bekannt und charakterisiert. Weitere Enzyme, z. B. für die Glykosylierung, Polymerisation oder andere Modifikationsreaktionen, sind noch nicht bekannt, ebenso wenig wie spezielle Transportproteine. Verschiedene V. vinifera-Gewebe, die VvMYB15, einen der beiden TFs, die sich als wichtige Regulatoren des Stilben-Biosynthesewegs erwiesen haben, überexprimieren, wurden im Vorfeld dieses Projekts für die Durchführung zweier Microarrays verwendet. Aus dieser Datenbank wurden Kandidatengene mit potentiell wichtigen vorhergesagten Funktionen durch ihre Hochregulierung identifiziert. Die ausgewählten Gene wurden dann mit Hilfe von in silico-Analysen und Promotor-Induktions-Assays gefiltert, bevor die Korrelation ihrer Genexpression mit dem Gehalt an modifizierten Stilbenen, von denen erwartet wird, dass sie durch ihre Reaktion produziert werden, untersucht wurde. Dies geschah in V. vinifera-Beeren verschiedener Entwicklungsstadien sowie in mit P. viticola infizierten Blattscheiben und ermöglichte die nähere Verknüpfung mehrerer Kandidatengene mit ihren erwarteten Produkten, wobei auch wertvolle Einblicke in die mögliche Rolle der Stilbene und damit der Gene während der Entwicklung oder bei der Abwehr einer Infektion gewonnen werden konnten. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die vielversprechendsten Kandidatengene, drei Glykosyltransferasen und eine Laccase, einer näheren biochemischen Charakterisierung durch Expression in Bakterien, Hefe oder Tabak und anschließendem enzymatischen Assay oder direkter HPLC- oder UHPLC/MS-Analyse unterzogen. Während die vollständige Charakterisierung der Kandidatengene noch aussteht, wurden für die Glykosyltransferasen vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich der Metabolisierung von Resveratrol und anderen Substraten sowie für die Beteiligung der Laccase und des Viniferins an Abwehrreaktionen erzielt.