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PNIPAM-containing droplets: The route towards an artificial cytoskeleton assembly based on synthetic and natural components

Sauter, Désirée

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Abstract

Although cells represent the smallest building blocks of life, they are already exhibiting a high level of complexity. It is therefore not surprising that researchers tend to utilize simplified systems for investigating, but also reconstituting, cellular processes in artificially constructed cells. The conception of those artificial cells can be done using bottom-up biological approaches. Currently, the reconstitution of cellular process is achieved using natural or nature-derived components like the actomyosin-complex for the reconstitution of cellular motility. Although a reduction of complexity can be accomplished in this way, natural systems still require specialized conditions and sophisticated buffers. Ultimately, the reduction of complexity can only be realized by the reconstitution of cellular processes using completely synthetic materials. In this thesis, a completely artificial cytoskeleton based on thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) to trigger motility of synthetic cells was established. To this end, a PNIPAM-based composite material containing gold nanorods was generated and its physiochemical behavior was characterized. The composite material was introduced and assembled inside water-in-oil emulsion droplets that have been stabilized by either a custom-made PNIPAM-containing surfactant (PNS) or a commercially available fluorosurfactant (CS). Besides the reversibility of the PNIPAM phase transition in bulk and droplet-based synthetic cells, the on-demand inducible deformation of droplets due to this phase transition was shown. Additionally, droplet migration was triggered using asymmetric PNIPAM-containing droplets in combination with fluorophilic-coated surfaces. The production of those cell polarization-mimicking droplets was achieved via targeted fusion of stable and unstable droplets during polymerization. Following the assessment of PNIPAM-mediated droplet motility, for the first time, the artificial cytoskeleton material was combined with the natural cytoskeleton protein actin by a sequential pico-injection approach thus elucidating the biocompatibility of the presented system. Herein, a versatile PNIPAM-based artificial cytoskeleton for synthetic cell applications was designed and implemented. The control over the PNIPAM volume transition processes allowed to achieve the motility of the droplet-based synthetic cells by their dynamic deformation. The biocompatibility of the system by combining natural and synthetic cytoskeleton components could be shown. The tolerance of the PNIPAM system also towards specialized buffer systems, might expand the bandwidth of the bottom-up synthetic biology tool kit, enhancing the assembly of hybrid cellular modules. Therefore, the developed approach represents an important milestone in the development of bottom-up synthetic biology applications.

Translation of abstract (German)

Obwohl Zellen die minimalen Bausteine des Lebens darstellen, weisen diese schon eine erheblich Komplexität auf. Es verwundert daher nicht, dass Forscher immer mehr dazu übergehen, reduzierte Systeme zur Erforschung und Implementierung von zellulären Prozessen in künstlichen Zellen zu verwenden. Die Konzeption solcher Systeme kann mit Hilfe der synthetischen Biologie, genauer von sogenannten Bottom-up-Verfahren bewerkstelligt werden. Obwohl diese Verfahren die Implementierung von zellulären Prozessen anhand von synthetischen Materialien erlauben, werden derzeit vor allem natürliche Systeme wie der Aktomyosinkomplex für die Rekonstruktion von Zellfunktionen verwendet. Obgleich dies schon eine Reduktion der Komplexität darstellt, benötigen natürliche Systeme immer noch spezialisierte Bedingungen und aufwendige Puffer. Die ultimative Reduktion der Komplexität bei der Rekonstitution von zellulären Prozessen kann deshalb nur mithilfe von synthetischen Materialien realisiert werden. Während dieser Doktorarbeit wurde deshalb ein künstliches Zytoskelett basierend auf wärmeempfindlichen Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM) zur Implementierung von Bewegung in künstlichen Zellen etabliert. Dafür wurde zunächst ein Kompositmaterial bestehend aus PNIPAM und stäbchenförmigen Goldpartikeln hergestellt und dieses bezüglich seiner chemischen und physikalischen Eigenschaften untersucht. Im Anschluss wurde das künstliche Zytoskelettmaterial in Wasser-in-Öl Tröpfchen eingekapselt. Die Tröpfchen wurden dabei entweder durch ein selbst-synthetisiertes Tensid auf PNIPAM-Basis oder durch ein kommerziell erhältliches Fluortensid stabilisiert. Neben der Reversibilität des Phasenübergangs von PNIPAM, der sowohl im makroskopischen Gelen, als auch in Tröpfchen-basierten synthetischen Zellen gezeigt werden konnte, konnte die induzierbare Deformation der Tröpfchen aufgrund dieses Vorgangs bei Temperaturänderung nachgewiesen werden. Folglich kann eine Temperaturerhöhung zur kontrollierten Manipulation der Tröpfchen genutzt werden. Zusätzlich wurde das implementierte Zytoskelettmaterial in Kombination mit fluorophilen Oberflächen, die zu erhöhter Oberflächen-Tröpfchen Reibung führten, verwendet, um die Migration von asymmetrischen Tröpfchen gezielt zu stimulieren. Die Herstellung dieser die Zellpolarisation nachahmenden Tröpfchen wurde dabei durch die gezielte Fusion von stabilen und instabilen Tröpfchen während der Polymerisation erreicht. Im Anschluss an die Untersuchung der PNIPAM-induzierten Tröpfchenmigration, wurde das künstliche Zytoskelettmaterial mit dem natürlichen Zytoskelettprotein Aktin durch einen sequenziellen Pico-Injektionsansatz in Emulsionströpfchen erstmalig kombiniert und somit die Biokompatibilität des implementierten Systems gezeigt. Durch das implementierte künstliche Zytoskelett konnte mittels der Kontrolle der Phasenübergangsprozesse von PNIPAM die Mobilität der Tröpfchen-basierten synthetischen Zellen durch deren dynamische Verformung erreicht werden. Zusätzlich konnte die Biokompatibilität des Systems durch die Kombination von natürlichen und synthetischen Zytoskelettkomponenten gezeigt werden. Die Toleranz des PNIPAM-Systems auch gegenüber spezialisierten Puffersystemen könnte die Bandbreite des Bottom-up-Werkzeugkastens der synthetischen Biologie erweitern und den Aufbau hybrider zellulärer Module verbessern. Daher stellt der entwickelte Ansatz einen wichtigen Meilenstein in der Entwicklung von Bottom-up-Anwendungen in der synthetischen Biologie dar.

Document type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Dr. Joachim P.
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 12 March 2021
Date Deposited: 16 Sep 2021 08:27
Date: 2021
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
DDC-classification: 540 Chemistry and allied sciences
570 Life sciences
Controlled Keywords: Mikrofluidik, Polyisopropylacrylamid <Poly(N-isopropylacrylamid)>, Motilität
Uncontrolled Keywords: organic-inorganic hybrid composite phase transition
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