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Essential Protein Factors in pre-mRNA splicing : A Structural Study by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Selenko, Philipp

German Title: Essenzielle Protein Faktoren des pre-mRNA Spleissens : eine Struckturbiologische Studie mit Kernresonanzspektroskopie

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Abstract

This thesis describes two novel three-dimensional structures and the functional characterization of proteins that play important roles in eukaryotic RNA splicing. These results are discussed in Chapters 1 and 2, while biomolecular NMR techniques that were employed for the structure determination are outlined in Chapter 3. Materials and methods are described in Chapter 4. Chapter 1 presents the solution structure of the Tudor domain of the human Survival of Motor Neuron (SMN) protein and its molecular interaction with the spliceosomal Sm proteins. Sm proteins are common components of small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs), which are assembled by a protein complex that contains SMN. The structure of the SMN Tudor domain exhibits a five stranded ?-barrel, which resembles the fold of Sm proteins. The Tudor domain of SMN binds to arginine and glycine-rich C-terminal regions of Sm proteins, where it specifically recognizes symmetrically di-methylated arginine residues. The E134K mutant Tudor domain, which corresponds to a human mutation associated with Spinal Muscular Atrophy (SMA), is structurally intact but fails to interact with Sm proteins. This provides an explanation for a molecular defect underlying SMA. In Chapter 2, the structural basis for the molecular recognition between the essential splicing factors SF1 and U2 auxiliary factor 2 (U2AF) is provided. This interaction involves the third RNA recognition motif (RRM3) of the large subunit of U2AF (U2AF65) and the N-terminal 25 residues of SF1. The structure of RRM3 exhibits the classical RNP-type fold, but contains an additional C-terminal helix. SF1 is bound by the helical surface of RRM3, opposite of the canonical RNA binding site. The molecular recognition involves insertion of a conserved tryptophan of SF1 into a hydrophobic binding pocket of RRM3. This interaction is complemented by electrostatic contacts that are mediated by acidic residues of RRM3 and basic amino acids of SF1. Surprisingly, the molecular interface is highly similar to that between the large (U2AF65) and small (U2AF35) subunits of U2AF. This RRM-mediated protein interaction provides an example of how conserved structural folds have evolved different molecular functions.

Translation of abstract (German)

In der vorliegende Arbeit werden neue drei-dimensionale Strukturen sowie die funktionelle Charakterisierung von Proteinen beschrieben, welche wichtige Funktionen für das RNA Spleissen in Eukaryonten ausführen. Diese Ergebnisse werden in Kapitel 1 und 2 diskutiert, während die biomolekularen NMR Techniken, welche für die Strukturbestimmung verwendet wurden, in Kapitel 3 erläutert werden. Experimentelle Methoden sind in Kapitel 4 beschrieben. In Kapitel 1 wird die Struktur der Tudor Domäne des menschlichen 'Survival of Motor Neuron' (SMN) Proteins, sowie dessen Wechselwirkung mit den spleissosomalen Sm Proteinen vorgestellt. Sm Proteine sind gemeinsame Bestandteile der 'small nuclear' Ribonukleoprotein Partikel (snRNP), die von einem Proteinkomplex assembliert werden, welcher SMN enthält. Die Struktur der SMN Tudor Domäne besteht aus einem 5-strängigen ?-Faltblatt, das der Faltung der Sm Proteine ähnelt. Die Tudor Domäne des SMN Proteins bindet an Arginin- und Glycin-reiche Sequenzen im C-Terminus der Sm Proteine. Dort erkennt es spezifisch symmetrisch dimethylierte Arginine. Die Struktur der E134K mutanten Tudor Domäne, welche einer genetischen Mutation der spinalen Muskelatrophy (SMA) entspricht, ist nicht beeinträchtigt, kann aber keine Sm Protein Bindung mehr vermitteln. Dies liefert eine Erklärung für einen molekularen Defekt welcher der SMA Krankheit zugrunde liegt. Kapitel 2 beschreibt die strukturelle Grundlage für die molekulare Erkennung zwischen den essentiellen Spleissfaktoren SF1 und 'U2 auxillary factor' (U2AF). Diese Interaktion wird durch das dritte 'RNA recognition motif' (RRM3) der grossen Untereinheit von U2AF (U2AF65) und den ersten 25 Aminosäuren von SF1 vermittelt. Die RRM3 Struktur entspricht der klassischen RNP Faltung, enthält jedoch eine zusätzliche C-terminale Helix. SF1 wird an einer helikalen Oberfläche gebunden, welche sich auf der Rückseite der kanonischen RNA Bindungsstelle befindet. Die molekulare Erkennung wird über einen Tryptophan Rest von SF1 koordiniert, welcher in eine hydrophobe Tasche der RRM3 Domäne bindet. Diese Interaktion wird zusätzlich durch komplementäre elektrostatische Kontakte der sauren Reste von RRM3 und der basischen Reste von SF1 verstärkt. Überraschenderweise, ist diese molekulare Erkennung fast identisch mit der zwischen der grossen (U2AF65) und kleinen (U2AF35) Untereinheit von U2AF. Diese RRM3-vermittelte Interaktion ist daher ein Bespiel für die Evolution unterschiedlich molekularer Funktionen einer weit verbreiteten Protein Domäne.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Jeremy Prof., Smith
Date of thesis defense: 28 November 2002
Date Deposited: 18 Dec 2002 08:04
Date: 2002
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Dreidimensionale NMR-Spektroskopie, RNS-Spleißen, Strukturaufklärung
Uncontrolled Keywords: NMR , Protein structure , RNA-splicing
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