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Phagozytose und Apoptose von Lymphozyten in der Immunpathogenese der HIV-Erkrankung

Kayßer, Philipp

English Title: Phagocytosis and Apoptosis of Lymphocytes in the Immunopathogenesis of HIV-Infection

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Abstract

Die Mechanismen des Verlustes von T-Lymphozyten im Verlauf der HIV-Infektion sind nicht abschließend geklärt und Gegenstand kontroverser Diskussion. Der Abfall der Zahl von T-Helferzellen im peripheren Blut korreliert mit erhöhter Autoantikörper- bzw. Immunkomplexbeladung (IgG, IgM, gp120, Komplementfaktoren) und gesteigerter Apoptoserate. Die Elimination immunkomplexbeladener Lymphozyten aus dem Kreislauf durch Makrophagen, die die opsonierten Lymphozyten phagozytieren, wurde durch M. C. Müller erstmalig im Jahre 1999 in seiner Dissertation im Lichtmikroskop nachgewiesen. In der hier vorliegenden Querschnittstudie wurden Phagozytose und Apoptose von Lymphozyten vergleichend durch Messung im Durchflusszytometer untersucht und mit Verlaufsparametern der HIV-Infektion in Bezug gesetzt, um die Rolle von Apoptose und Phagozytose in der Pathogenese der HIV-Erkrankung zu ermitteln. Im peripheren Blut von HIV-Infizierten wurden CD4-Zellzahl und Antikörperbeladung durchflusszytometrisch, die Viruslast mittels bDNA-Test quantitativ ermittelt. Zur Messung der Phagozytose von Lymphozyten durch autologe Makrophagen wurde ein neuer in-vitro-Test für das Durchflusszytometer mit intrazellulärer Anfärbung von Lymphozytenmarkern entwickelt. Als Positivkontrolle und Modell zur Opsoninbeladung der Lymphozyten diente die Inkubation mit Antithymozytenglobulin (ATG). Die Phagozytose wurde zusätzlich noch lichtmikroskopisch gemessen. Die Messung der Apoptose erfolgte durch Anfärbung von Phosphatidylserin auf der Membranaußenseite apoptotischer Zellen mit Annexin-V-FITC, Gegenfärbung toter Zellen mit 7-Aminoactinomycin D und Analyse im Durchflusszytometer. Untersucht wurden insgesamt 49 HIV-positive Patienten aller CDC-Stadien und 11 gesunde Kontrollpersonen. Es zeigten sich ein deutlicher Verlust von CD4+ Zellen und eine signifikante Erhöhung der IgG-Beladung von T-Helferzellen bei HIV-positiven Patienten im Verlauf der Infektion gegenüber gesunden Kontrollpersonen. Die durchflusszytometrisch gemessene Phagozytoserate von CD4+ und CD8+ Zellen war bei Infizierten gegenüber Kontrollen signifikant erhöht, wobei signifikant mehr CD4+ als CD8+ Zellen bei HIV-Patienten phagozytiert wurden. HIV-positive Patienten mit hoher Viruslast phagozytierten signifikant weniger CD4+ und CD8+ Zellen als Patienten mit geringer Virämie. Bei der Messung der Apoptose (n = 20 Patienten und n = 8 Kontrollen) stellte sich eine signifikant erhöhte Apoptoserate von CD4+ Zellen und von aus Monozyten abgeleiteten Makrophagen bei HIV-Positiven heraus. Für CD8+ Zellen und NK-Zellen ergab sich kein signifikanter Unterschied. Die Apoptoseraten von CD4+ und CD8+ Zellen korrelierten nicht mit den Phagozytoseraten. T-Zell-spezifische Immunkomplexe auf Lymphozyten stellen einen häufigen Befund bei HIV-Infizierten dar. Die Phagozytose von derart opsonierten T-Lymphozyten durch autologe Makrophagen wurde in dieser Querschnittstudie erstmalig im Durchflusszytometer nachgewiesen und quantifiziert. Die Ermittlung von Apoptoseraten bestätigte von anderen Autoren publizierte Ergebnisse. Aufgrund der hier gezeigten Befunde kann von Phagozytose und Apoptose als zwei getrennten pathogenetischen Mechanismen zur Lymphozytendepletion bei der HIV-Erkrankung ausgegangen werden. Sowohl in der Phagozytosemessung als auch in der Untersuchung der Apoptose stellen sich die jeweiligen Zellpopulationen sehr different dar, so dass weitergehende longitudinale Studien nicht nur den Verlust von T-Helferzellen zum Gegenstand haben, sondern vor allem CD8+ Zellen und Monozyten miterfassen sollten.

Translation of abstract (English)

The loss of CD4+ cells during HIV-infection correlates with elevated autoantibody/immune-complex-coating and a higher rate of lymphocyte apoptosis. The elimination of immunecomplex coated lymphocytes from circulation by phagocytosis of autologous macrophages has been shown by Müller in 1999 using light microscopy. In this study we compared phagocytosis and apoptosis of lymphocytes using a flow cytometric assay to determine their role in the pathogenesis of HIV-infection. A new in-vitro flow cytometric assay for determining the rate of phagocytosis of lymphocytes was developed and evaluated. We also used flow cytometry to quantify apoptosis by Annexin-V-FITC, the CD4-count and antibody coating (IgG) of lymphocytes. The viral load was assessed by a bDNA-assay. HIV-positive patients (n = 49, all CDC stages) had a significantly higher IgG coating on CD4+ cells compared to healthy controls (n = 11). The rate of phagocytosis of CD4+ and CD8+ cells was also significantly higher in HIV and more CD4+ cells than CD8+ cells were phagocytized. Macrophages of HIV-positive patients with high viral load phagocytized significantly less CD4+ and CD8+ cells than patients with low viraemia. Apoptosis measurements (n = 20 patients and n = 8 controls) showed significantly elevated levels of apoptosis of CD4+ cells and monocytes/macrophages in HIV-infected individuals. There was no significant correlation between apoptosis and phagocytosis of T-cells. Apoptosis of CD4 cells and monocytes showed a greater difference between HIV-positive persons and healthy controls compared to CD8 lymphocytes. Regarding the findings of this study we suggest apoptosis and phagocytosis to be two separate mechanisms in the pathogenesis of lymphocyte depletion. In both, phagocytosis and apoptosis measurements, lymphocyte subsets showed very different rates. Further studies should not only investigate CD4+ cell depletion but consider CD8+ cells and monocytes as well.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wisser, Dr. rer. Hermannnat
Date of thesis defense: 23. October 2002
Date Deposited: 13. Dec 2002 10:41
Date: 2002
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Institut für Klinische Chemie
Subjects: 610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Apoptosis, Phagozytose, Lymphozyt, HIV-Infektion, FACS
Uncontrolled Keywords: phogocytosis , apoptosis , HIV , lymphocyte , FACS
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