German Title: Entwicklung von fluorogenen Substraten für die NAD(P)-Snifits zur Untersuchung des Nicotinamidadenindinukleotid Metabolismus in primären Neuronen

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PDF, English - main document Download (43MB) | Lizenz: Development of fluorogenic substrates for NAD(P)‑Snifits enables the investigation of nicotinamide adenine dinucleotide metabolism in primary neurons by Raith, Fabio underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0

Abstract

The members of the cofactor family of nicotinamide adenine dinucleotides are involved in many biological processes. New insights about their role in health and disease have highlighted the need to measure these metabolites in live cells. Fluorescent biosensors have been proven to be valuable tools for metabolite measurements with subcellular resolution. Among them, the NAD(P)‑Snifits have been developed to measure free NAD⁺ levels and NADPH/NADP⁺ ratios, respectively. The applicability of these FRET‑based biosensors in physiological relevant model systems is limited by the permeability of the tetramethylrhodamine (TMR)‑based FRET donor substrate and its SNAP‑tag labelling. In this work, fluorogenic FRET donor substrates were developed by manipulating the spirocyclization equilibrium of TMR. Their permeability and cellular SNAP‑tag labelling outperformed early versions of these substrates, especially when they were derivatized with an optimized SPR inhibitor. Systematic characterization selected two FRET donor substrates that could also label the NAD(P)‑Snifits in cultured primary neurons. Consequently, free subcellular NAD⁺ levels and NADPH/NADP⁺ ratios could be measured for the first time in primary neurons. These improvements allowed the comparison of free subcellular NAD⁺ levels and NADPH/NADP⁺ ratios between U2OS cells and primary neurons by FLIM‑FRET measurements. Significant differences were revealed in free mitochondrial NAD⁺ levels and NADPH/NADP⁺ ratios, which could be the result of differences in oxidative phosphorylation activity and have not been described before. In short, this work provides new tools for the quantification of NAD(P) metabolites in physiological relevant model system and thus help to gain new insights into their metabolism.

Translation of abstract (German)

Die Mitglieder der Cofaktor-Familie der Nicotinamidadenindinukleotide sind an vielen biologischen Prozessen beteiligt. Neue Erkenntnisse über ihre Rolle im Stoffwechsel und bei der Entstehung von Krankheiten haben die Notwendigkeit deutlich gemacht, diese Metaboliten in lebenden Zellen zu messen. Fluoreszierende Biosensoren haben sich als wertvolle Instrumente für Messungen von Metaboliten mit subzellulärer Auflösung erwiesen. Die NAD(P)-Snifits wurden für die Messungen von freien NAD⁺ Gehältern bzw. NADPH/NADP⁺ Verhältnissen entwickelt. Die Anwendbarkeit dieser FRET-basierten Biosensoren in physiologisch relevanten Modellsystemen ist durch die Permeabilität des Tetramethylrhodamin (TMR)-basierten Substrats für den FRET Donor und dessen SNAP-Tag Markierung begrenzt. In dieser Arbeit wurden fluorogene Substrate für den FRET Donor durch Manipulation des Spirozyklisierungsgleichgewichtes von TMR entwickelt. Ihre Permeabilität und die zelluläre SNAP-Tag Markierung übertrafen frühere Versionen, insbesondere wenn sie mit einem optimierten SPR-Inhibitor derivatisiert wurden. Durch systematische Charakterisierung wurden zwei Substrate für den FRET Donor ausgewählt, die auch die NAD(P)-Snifits in kultivierten primären Neuronen markieren können. Dadurch konnten zum ersten Mal freie subzelluläre NAD⁺ Gehälter und NADPH/NADP⁺ Verhältnisse in primären Neuronen gemessen werden. Diese Verbesserungen ermöglichten den Vergleich der freien subzellulären NAD⁺ Gehälter und NADPH/NADP⁺ Verhältnisse zwischen U2OS Zellen und primären Neuronen mittels FLIM-FRET Messungen. Es wurden signifikante Unterschiede an freiem NAD⁺ Gehältern und NADPH/NADP⁺ Verhältnissen in den Mitochondrien festgestellt, die auf Unterschiede in der Aktivität der oxidativen Phosphorylierung zurückzuführen sein könnten und bisher nicht beschrieben wurden. Zusammenfassend liefert diese Arbeit neue Werkzeuge für die Bestimmung von NAD(P) Metaboliten in physiologisch relevanten Modellsystemen und trägt somit zur Gewinnung von neuen Erkenntnissen über ihren Stoffwechsel bei.