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Untersuchungen zur Assoziation des transkriptionellen Repressors Snail aus Drosophila melanogaster mit den Korepressoren CtBP und HDAC1

Belz, Thorsten

English Title: Investigations to the association of the transcriptional repressor Snail from Drosophila melanogaster with the corepressors CtBP and HDAC1

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PDF, German
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Abstract

Die DNA eukaryotischer Organsimen assoziiert im Zellkern mit Histonen und weiteren Proteinen zu Chromatin. Die nukleosomalen Histone, verantwortlich für die Kondensation der DNA in Nukleosomen, enthalten in ihren NH2-terminalen Domänen hochkonservierte Lysinreste, die unter anderem von Histon-Acetyltransferasen (HAT) bzw. Histon-Deacetylasen (HDAC) reversibel modifiziert werden. Histon-Acetylierung destabilisiert vermutlich die Chromatinstruktur und ermöglicht so, dass Transkriptionsfaktoren und/oder die generelle RNA-Polymerase II Transkriptionsmaschinerie an Zielgene binden und deren Expression aktivieren können. Im Gegensatz dazu bewirkt Histon-Deacetylierung Chromatinkondensation und somit Transkriptionsrepression. Die „Histon-Kode“ Hypothese postuliert, dass spezifische Histonmodifikationsmuster mit der Ausführung bestimmter DNA-abhängiger Prozesse wie z.B. Transkritpionsaktivierung oder -repression korrelieren. Die funktionelle Verknüpfung von Histon-Acetylierung bzw. -Deacetylierung mit Transkriptionsregulation basiert auf der Assoziation der HATs und HDACs, die als Koaktivatoren und Korepressoren wirken, mit Aktivatoren bzw. Repressoren. Drosophila Repressoren sind unter anderem für die Regulation der Genexpression während der Körpermusterbildung und der Bildung der Primärgewebe essentiell. Der Zinkfinger Repressor Snail etabliert die Grenze zwischen prospektivem Mesoderm und Neuroektoderm im frühen Embryo. Während Studien, die sowohl eine physikalische als auch genetische Interaktion zwischen Snail und dem Korepressor CtBP zeigten, auf einen CtBP-vermittelten Mechanismus deuten, zeigten eigene Studien eine Assoziation von Snail mit HDAC-Aktivität und lassen somit vermuten, dass HDAC-Aktivität and der Snail-vermittelten Transkriptionsrepression beteiligt ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion des Repressors Snail mit HDAC-Aktivität funktional charakterisiert. Mit Hilfe von Kopräzipitationsexperimenten unter Verwendung von rekombinantem Snail und embryonalem Drosophila Kernextrakt konnte die Assoziation von Snail mit CtBP oder HDAC1 gezeigt werden. Ein für die vorliegende Arbeit in Kaninchen etablierter anti-Snail Antikörper immunopräzipitierte einen nativen Snail-HDAC1-Komplex aus Kernextrakt, der kein CtBP enthält. Diese Experimente deuten an, dass Snail zwei unterschiedliche Korepressorkomplexe rekrutiert. Weitere Protein/Protein Interaktionsstudien zeigten eine Assoziation von CtBP und HDAC1 im frühen Drosophila Embryo. Da endogenes Snail mit HDAC1 interagiert, nicht jedoch mit dem CtBP-HDAC1-Komplex, scheint die Assoziation von HDAC1 und CtBP die Interaktion zu Snail zu inhibieren. Um die beiden putativen HDAC1 Komplexe, Snail-HDAC1 und CtBP-HDAC1, funktional zu chrakterisieren, wurden sie auf ihre HDAC-Aktivität hin untersucht. Diese Untersuchungen zeigten, dass die mit Snail assoziierte HDAC aktiv ist, während die mit CtBP-assoziierte HDAC inaktiv ist. Diese Experimente deuten an, dass CtBP die Aktivität assoziierter HDAC(s) inhibiert. Möglich ist auch, dass HDAC1 in beiden Komplexen inaktiv ist, aber Snail mit einer zweiten, nicht charakterisierten, aktiven HDAC assoziiert ist. Dagegen spricht, dass Snail ausser mit HDAC1 mit keiner weiteren bekannten Drosophila HDAC-Aktivität interagiert. Die Resultate dieser Arbeit lassen vermuten, dass Snail-abhängige Repression der Transkription durch mindestens zwei funktionell unterschiedliche Korepressor-Komplexe, Snail-CtBP- und Snail-HDAC1, vermittelt wird, die möglicherweise Entwicklungsstadium-, Gen- oder Zelltyp-spezifisch rekrutiert werden, um die Transkription zu reprimieren.

Translation of abstract (English)

The DNA of eukaryotic organisms in the cell nucleus is associated with histones and other proteins. This association causes condensation of the DNA. The core histones contain highly conserved lysine residues within their NH2-terminal domain. These lysine residues can be reversibly modified, i.e. histone acetylation or histone deacetylation by histone-acetyltransferases (HATs) or histone-deacetylases (HDACs) respectively. Histone acetlyation presumably leads to destabilization of the chromatin structure, whereby transcription factors and/or the general RNA-polymerase II transcription machinery can bind to target genes. Histone deacetylation on the other hand causes condensation of the chromatin structure and thereby leads to repression of transcription. The „histone code“ hypothesis postulates a correlation between distinct histone modification patterns and DNA-dependent processes like activation or repression of transcription. The functional link between histone acetylation and deacetylation with transcriptional regulation is based on the association of HATs and HDACs with activators and repressors. Repressors are essential for segmentation and body pattern formation in Drosophila. The zinc finger repressor Snail is responsible for the establishment of the mesoderm-neuroectoderm boundary in the early Drosophila embryo. The functional and physical interaction between Snail and the corepressor CtBP suggest a CtBP-mediated mechanism. Our studies reveal an association of Snail with HDAC-activity and suggest a participation of HDAC-activity in Snail-mediated transcriptional repression. Within the scope of this work the interaction of the Drosophila repressor Snail with HDAC-activity has been investigated. Coprecipitation experiments with recombinant Snail and embryonic Drosophila nuclear extract showed an association of Snail with CtBP or HDAC1. An anti-Snail antibody, established for this work in rabbit, immunoprecipitated a native Snail-HDAC1 complex from nuclear extract, without CtBP. These experiments suggest that Snail recruits two different corepressor complexes. Further protein/protein interaction studies revealed an association of CtBP and HDAC1 in the early Drosophila Embryo. Since endogenous Snail interacts with HDAC1 but not with the CtBP-HDAC1 complex, the association between CtBP and HDAC1 seems to inhibit the interaction with Snail. A functional characterization of the two complexes, Snail-HDAC1 and CtBP-HDAC1, demonstrated that the Snail associated HDAC is active, whereas the CtBP associated HDAC is inactive. These experiments suggest that CtBP inhibits the activity of associated HDAC(s). Another possibility is that HDAC1 in both complexes is inactive, only Snail is associated with a second, not characterized active HDAC. However, this is unlikely because Snail does not interact with any known Drosophila HDAC-activity apart from HDAC1. The results of this work sugggest that Snail-dependent transcriptional repression is mediated through at least two different corepressor complexes, Snail-CtBP and Snail-HDAC1. The different complexes are posssibly recruited in a developmental stage-, gene- or cell type specific manner to repress transcription.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sauer, Dr. PD Frank
Date of thesis defense: 30 January 2003
Date Deposited: 26 Feb 2003 09:57
Date: 2002
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Genregulation, Corepressor, Taufliege, Chromatin, Desacetylierung, Histon-Acetyltransferase
Uncontrolled Keywords: Histon-Deacetylierung , Histon-Acetylierung , HDAC1 , CtBP , Snailhistone deacetylation , histone acetylation , HDAC1 , CtBP , Snail
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