English Title: Identification and characterization of histone methyltransferases in Drosophila melanogaster

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Abstract

In eukaryotischen Zellen ist die DNA mit Histonen und anderen chromosomalen Proteinen zu Chromatin komplexiert. Das sich wiederholende Grundelement des Chromatins, das Nukleoso-m, besteht aus je zwei Kopien der Histone H2A, H2B, H3 und H4, um die 146 Ba-senpaare DNA gewunden sind. Durch Kondensierung der Nukleosomenreihen bilden sich übergeordnete Chromatinstrukturen, die noch wenig verstanden sind. Zur Ausführung DNA-abhängiger Prozesse muss die Verpackung der DNA teilweise gelockert werden, um zu ge-währleisten, dass die ausführenden Proteine Zugang zu ihren Zielsequenzen haben. Daher existieren verschiedene biochemische Systeme, die die grundlegende Struktur des Chromatins dynamisch kontrollieren. Das Zusammenspiel verschiedener Histonmodifizierungen, wie Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Methylierung setzt sowohl synergisti-sche als auch antagonistische Signale, die mit der Häufigkeit, mit der ein Gen transkribiert wird, korrelieren. Dieser „Histoncode“ erzeugt eine Architektur des Chromatins, die von Nichthistonproteinen erkannt wird und dann den Übergang zwischen transkriptionsaktiven und –inaktiven Chromatindomänen bewirken. Untersuchungen in den 1970er und 1980er Jahren zeigten für die Histonmethylierung, die sowohl an Argininen als auch an Lysinen erfolgen kann, eine Beteiligung an der eu- und hete-rochromatischen Transkriptionsregulation. Enzyme, die Histone methylieren können, waren jedoch zu Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Durch die chromatographische Fraktionierung von embryonalem Drosophila-Kernex-trakt konnten hier drei argininspezifische Histonmethyltransferasen identifiziert werden, die den Säugerproteinen CARM1, PRMT1 und PRMT3 homolog sind. Die cDNAs wurden klo-niert und die rekombinanten Proteine biochemisch charakterisiert. Während dieser Arbeit wurden von anderen Gruppen mehrere lysinspezifische Histon-methyltransferasen mit dem katalytisch aktiven Cys-SET(-Domäne)-Cys-Sequenzmotiv in Säugern und Hefe identifiziert. Außerdem wurde eine zentrale Rolle der lysinspezifischen Histonmethylierung in der epigenetischen Genrepression gezeigt. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden sieben in Drosophila vorkommende Cys-SET-Cys-Proteine identifiziert und kloniert. Für alle Proteine wurde Histonmethyltransferase-Aktivität mit teilweise unterschiedlicher Substratspezifität gezeigt. Darunter befindet sich auch ASH1 (Absent, Small or Homeotic discs), ein bekannter epigenetischer Aktivator der Trithorax-Gruppe. ASH1 methyliert in Histon H3 Lysin 4 und 9 und in Histon H4 Lysin 20. Die ASH1-abhängige Transkriptionsaktivierung konnte mit der Methylierung der drei Lysin-reste in der Promotorregion von ASH1-Zielgenen korreliert werden. Mittels in vitro Interakti-onsexperimenten und Chromatin-Immunpräzipitationen konnte gezeigt werden, dass durch ASH1-vermittelte Histonmethylierung die Assoziation von Repressoren, wie Polycomb und Heterochromatin-Protein 1 (HP1), verhindert wird. Außerdem konnte eine Korrelation zwi-schen der epigenetischen ASH1-abhängigen Aktivierung der Ultrabithorax-Transkription in Drosophila mit ASH1-vermittelter Histonmethylierung und Rekrutierung oder Stabilisierung der Bindung des aktivierenden Chromatin-Remodelling-Komplexes BRAHMA, dem Dro-sophila SWI/SNF-Homolog, nachgewiesen werden. Die Histonmethyltransferase-Aktivität von ASH1 könnte daher spezifische Signale für die Etablierung epigenetisch aktiver Transkriptionsmuster setzen. Diese Arbeit legt die Grundlagen für die Einbeziehung des Modellsystems Drosophila melanogaster in die Erforschung der Funktionen der Histonmethylierung, für ein besseres Verständnis der epigenetischen Aktivierung und erweitert die Komplexität des „Histoncodes“.

Translation of abstract (English)

The tight association of chromosomal DNA with proteins, mainly histones, represents a barrier for DNA-dependent processes. To overcome this barrier, eukaryotes have evolved refined mechanisms that regulate the association of chromosomes with DNA. In particular posttranslational modifications of histones , i.e. acetylation, methylation, ubiquitination or phosphorylation have been linked with the execution of DNA-dependent processes. The knowledge that the majority of proteins, that acetylate histones function as transcription factors or coactivators of transcription has acetylation of histones intimately connected with activation of eukaryotic gene expression. Like acetylation methylation of hisotnes has been correlated with transcription but unlike acetylation proteins which methylate histones during the processes of transcriptional regulation were unknown at the beginning of this work. To decipher the functional link between histone methylation and transcription we sought to identify histone methyltransferases (HMTs). To reach this goal we used the model system Drosophila which is amenable to the biochemical and genetic manipulations that are necessary to decipher the molecular mechanisms underlying HMT-mediated transcription in vitro and in the context living cells. The chromatographic fractionation of embryonic nuclear extracts revealed that Drosophila contains several HMTs. Three of them have been identified. They are homologs of the known mammalian arginine specific HMTs CARM1, PRMT1 and PRMT3. The cDNAs of them have been cloned and the recombinant proteins have been characterized. In a second, bioinformatical, approach seven proteins have been identified containing the Cys-SET-Cys sequence motif, which is responsible for lysine specific methylation. One of them is the epigenetic activator ASH1. ASH1 is a multi-catalytic HMT that methylates lysine residues 4 and 9 in H3 and 20 in H4. Transcriptional activation by ASH1 coincides with methylation of these three lysine residues at the promoter of ASH1 target genes. The methylation pattern placed by ASH1 may serve as a binding surface for a chromatin remodeling complex containing the epigenetic activator BRAHMA, an ATPase, and inhibits the interaction of epigenetic repressors with chromatin. Chromatin immunoprecipitation indicates that epigenetic activation of Ultrabithorax transcription in Drosophila coincides with trivalent methylation by Ash1 and recruitment of BRM. Thus, histone methylation by Ash1 may provide a specific signal for the establishment of epigenetic, active transcription patterns.