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Single-Molecule Characterization of Photophysical and Colloidal Properties of Biocompatible Quantum Dots

Doose, Sören

German Title: Einzelmolekül-Charakterisierung der Photophysikalischen und Kolloidalen Eigenschaften von Biokompatiblen Quantenpunkten

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Abstract

Colloidal semiconductor nanocrystals (NCs) have recently been introduced as novel fluorescent labels for various biological applications. Their unique optical properties — tunable narrow emission spectrum, broad excitation spectrum, high photostability and long fluorescent lifetimes (on the order of tens of nanoseconds) — make them attractive probes in experiments involving long observation times, multicolor and time-gated detection. Photophysical properties were investigated at the ensemble and single-molecule level for CdSe or CdTe core, CdSe/ZnS core-shell and surface-modified NCs. The use of NCs as fluorescent probes in biological applications requires various synthesis routes and surface modifications to enable solubility in aqueous solution and to allow labeling of biological macromolecules. Due to NC’s sensitivity to surface-defects chemical treatments have a significant influence on photophysical properties and need to be thoroughly monitored. Single-molecule fluorescence detection was used to characterize NC fluorescence, observe intermittency in the emission (blinking), and unravel a non-fluorescent subpopulation of NCs whose fluorescence can be restored through photo-induced activation. Stage-scanning confocal, epifluorescence and objective-type total-internal-reflection microscopy, were applied to observe surface-immobilized NCs. Fluorescence lifetimes were determined to be around 20 ns for single particles showing deviations from a mono-exponential decay. This observation was proven to be characteristic of single particles by monitoring photon antibunching. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) was used to characterize photophysical and colloidal properties in solution. It was shown to be a powerful technique to rapidly evaluate information on synthesis and surface modifications. These are essential to achieve water-solubility and bio-conjugation and dramatically influence the optical performance. FCS allows measuring concentration of fluorescent particles, an average brightness and particle size. From these observables, the brightness per particle can be estimated, something not possible in ensemble measurements due to the presence of absorbing but dark particles. The ratio of dark to fluorescent NCs was estimated and concentration changes due to photo-induced activation were observed. Particle sizes measured by FCS were compared to transmission electron microscopy and found in good agreement down to 7 nm. The correlation amplitude was observed to be excitation power dependent which was attributed to saturation and optical trapping effects. An electronic polarizability was evaluated and found to be two orders of magnitude larger than reported for measurements at non-resonant wavelength. Monte-Carlo simulations (MCS) were performed to compute autocorrelation functions under the influence of power-law blinking. Diffusion through a confocal volume, excitation-emission cycles with defined rate constants and on/off blinking were incorporated into MCS and used to investigate influences of saturation, size-distributions, photobleaching and blinking. The results were compared to experimental data of various NCs. Simulations account for both types of experimentally observed effects of blinking in FCS curves: significant deviation from a diffusion-model observed at high excitation powers; and no deviation from a diffusion-model despite the existence of blinking, observed at low excitation powers. Simulations showed that blinking does not influence FCS data for certain power law parameters.

Translation of abstract (German)

Kolloidale Halbleiter-Nanokristalle stellen eine neue Klasse von Fluoreszenzsonden für biologische Anwendungen dar. Aufgrund ihrer besonderen optischen Eigenschaften — durchstimmbares, schmales Emissionsspektrum, kontinuierliches Anregungsspektrum, hohe Photostabilität und lange Fluoreszenzlebensdauern (in der Größenordnung von 10 ns) — eignen diese sich besonders für Experimente, die lange Beobachtungzeiten, Detektion von mehreren Farben oder eine zeitlich selektierte Detektion erfordern. Photophysikalische Eigenschaften von CdSe oder CdTe Kern, CdSe/ZnS Kern/Schale und oberflächenmodifizierten Nanokristallen sind auf Ensemble- und Einzelmolekülebene untersucht worden. Eine Vielzahl von Syntheserouten und Oberflächenmodifikationen, die Löslichkeit in wässrigen Medien und Markierung von biologischen Makromolekülen ermöglichen, sind Voraussetzung für biologische Anwendungen. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit auf Oberflächenzustände haben chemische Modifikationen grosse Auswirkungen auf die photophysikalischen Eigenschaften, die genau kontrolliert werden müssen. Fluoreszenz von Nanokristallen wurde mittels Einzelmolekülmethoden charakterisiert, Intensitätsfluktuationen untersucht und eine nicht fluoreszierende Subpopulation entdeckt, die über lichtinduzierte Prozesse reaktiviert werden kann. Konfokale Scanning-Stage-, Epifluoreszenz- und Total-Internal-Reflection-Mikroskopie wurden verwendet, um auf Glas immobilisierte Nanokristalle zu beobachten. Messung der Fluoreszenzlebensdauern ergaben Werte von ca. 20 ns für einzelne Nanokristalle, wobei Abweichungen von einem monoexponentiellen Verhalten sichtbar wurden. Durch die Beobachtung von Photon-Antibunching konnte nachgewiesen werden, dass diese Eigenschaften charakteristisch für einzelne Teilchen sind. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) fand Verwendung, um photophysikalische und kolloidale Eigenschaften von Nanokristallen in Lösung zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass FCS eine wertvolle Methode darstellt, um Information zu Synthese und Oberflächenmodifikationen zu gewinnen. FCS ermöglicht die Messung der Konzentration fluoreszierender Teilchen, einer mittleren Intensität und der Teilchengröße. Aus diesen kann die Fluoreszenzintensität pro Teilchen abgeleitet werden, was mit Ensemblemethoden nicht erreicht werden kann, solange eine Subpopulation von absorbierenden aber nicht emittierenden Teilchen präsent ist. Das Verhältnis von dunklen zu fluoreszierenden Teilchen wurde bestimmt und Änderungen der Konzentration durch lichtinduzierte Aktivierung beobachtet. Mit FCS gemessene Teilchengrößen wurden mit Messungen mittels Transmissionselektronenmikroskopie verglichen und gute Übereinstimmung für Teilchen von 7 nm gefunden. Es wurde beobachtet, dass die Korrelationsamplitude von der Anregungsenergie abhängt, was durch Einflüsse von Sättigung und optischen Kräften (optical trapping) erklärt werden kann. Für die Polarisierbarkeit ergaben sich Werte, die zwei Größenordnungen über Literaturwerten liegen, die auf Messungen mit nicht-resonanten Wellenlängen basieren. Monte-Carlo Simulationen (MCS) wurden durchgeführt, um Korrelationsfunktionen unter dem Einfluss von Intensitätsschwankungen (Blinken), die einem Potenzgesetz folgen, zu berechnen. Zu diesem Zweck wurden Diffusion durch ein konfokales Beobachtungsvolumen, Absorptions-Emissions-Zyklen mit definierten Zeitkonstanten und Blinken in die MCS integriert. Einflüsse von Sättigung, Größenverteilungen, photochemische Zersetzung und Blinken konnten simuliert und mit experimentellen Daten verglichen werden. MCS reproduzieren zwei Effekte, die durch den Einfluss von Blinken auf FCS Kurven experimentell beobachtet werden: (i) deutliche Abweichung von einem Diffusionsmodell bei hohen Anregungsenergien; (ii) keine Abweichungen von diesem Modell bei niedrigen Anregungsenergien. Simulationen ergaben, dass FCS für gewisse Potenzgesetze nicht vom Blinken beeinflusst wird.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wolfrum, Prof. Dr. Jürgen
Date of thesis defense: 31 October 2003
Date Deposited: 13 Nov 2003 11:53
Date: 2003
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Einzelmolekülspektroskopie, Quantenpunkt
Uncontrolled Keywords: Nanokristall , Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie , CdSeSingle-Molecule Spectroscopy , Quantum Dot , Nanocrystal , Fluorescence Correlation Spectroscopy , CdSe
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