English Title: 1. Generation of HPV16 recombinant plant virus for the production of viral genes in legumes : 2. Modulation of an HPV16 DNA vaccine

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Abstract

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde versucht basierend auf einem Pflanzen-Virus-Vektorsystem verschiedene HPV16 rekombinante Viren herzustellen. Als Träger der HPV16-Sequenzen wurde die RNA-2 des Cowpea Mosaic Virus verwendet. Ziel war die billige Herstellungsweise einer anti-HPV16-Vakzine in Pflanzen (Vigna unguiculata) im großen Maßstab. Zu diesem Zweck wurden die HPV16-Gene L1 und E7 in das CPMV-Vektorsystem einkloniert und mit zwei unterschiedlichen Methoden in Pflanzen appliziert. Die ersten Experimente wurden mit der HPV16-rekombinanten cDNA-2 (RNA-2) mittels der mechanischen Inokulation durchgeführt. Mit dieser Methode konnte allerdings nur mit den Kontroll-Konstrukten (cDNA-2, cDNA-2-GFP) eine systemische CPMV-Infektion an Hand der Symptome beobachtet werden. Alle anderen Experimente mit den rekombinanten Konstrukten (HPV16L1) schlugen fehl. Auch ein effektiveres Inokulationssystem (Agrobakterien-Inokulation) resultierte abgesehen von den Kontroll-Konstrukten in keinem positiven Ergebnis. Innerhalb der oben beschriebenen Experimente sollte der Einfluss des Pflanzen-Kodon-optimierten HPV16E7 auf die Protein-Expression untersucht werden. Dies konnte allerdings aufgrund der negativen Ergebnisse in den Pflanzen nicht analysiert werden. Aus diesem Grund wurde der Einfluss des „Codon Usage“, allerdings mit den humanisierten HPV16-Genen E7 und L1 in DNA-Immunisierungs-Experimenten weiterverfolgt. Unterschiedlich modifizierte HPV16-DNA-Konstrukte wurden als DNA-Vakzine intramuskulär in Mäuse appliziert und mittels Elispot und Zytotoxizitätstest die zelluläre Immunantwort analysiert. In allen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Humanisierung der HPV16-Gene den größten Einfluss auf die Immunogenität hat und dass die zusätzliche Fusion der Kozak-Sequenz am 5´-Ende der HPV16E7-Sequenzen eher einen geringen Einfluss ausübte. Als Hauptursache für die verbesserte Immunogenität der humanisierten E7-Konstrukte, im Vergleich mit dem unmodifizierten E7-Wild-Typ-Gen, wurde die erhöhte Translation und damit die verstärkte E7-Protein-Expression vermutet. Um diese Hypothese zu bestätigen, wurden die modifizierten E7-Konstrukte in transienten Transfektion-Experimenten (293T-Zellen) analysiert. Vergleicht man nun die Daten aus den DNA-Immunisierungen und den Transfektionen, so erkennt man eine direkte Korrelation der verstärkten Expression in vitro und einer ebenso verbesserten Immunogenität in vivo. Dies gilt allerdings nur für die zelluläre Immunantwort und nicht für die humorale (ähnliche niedrige Antikörper).

Translation of abstract (English)

In the first part of the thesis has been tried to generate HPV-16 recombinant plant virus, based on a plant virus vector system. As carrier of HPV-16 sequences has been used RNA-2 of the cowpea mosaic virus. The aim of the thesis was to establish a cheaper method for the production of an anti HPV-16 vaccine in plants (Vigna unguiculata) in a larger scale. For this purpose HPV-16L1 and E7 genes has been inserted in the cpmv (cowpea mosaic virus) vector system and subsequently inoculated in plants with to different methods. In the first experiments we used HPV-16 recombinant cDNA-2 (RNA-2) for mechanical inoculation on to plant leaves. But only the control construct (cDNA-2, cDNA-2-GFP) showed positive results with this inoculation method, detectable through viral symptoms. All the other experiments with HPV-16 recombinant constructs were negative. Even the usage of a much more efficient inocluation method (agrobcateria inoculation) resulted only in the systemic infection with CPMV-GFP (control construct). With the experiments described above should be analysed the influence of a plant codon optimised HPV-16E7 gene on protein expression. This parameter couldn´t be evaluated because of the negative results in plant experiments. Therefore it has been analysed the „codon usage“ with an humanised HPV-16 E7 and L1 gene in DNA vaccination studies. Different modified HPV-16E7 constructs has been injected intramuscularly in mice and analysed the cellular immune response with the help of Elispot and chromium release assay. All immunisation experiments showed in Elispot analysis that the humanised E7 construct had the biggest impact on the immune response, followed by the E7 construct with an additional kozak sequence in front of the gene, which showed only a little influence. It has been supposed that the main reason for the improved immunogenicity of the humanised E7 construct in comparison with an unmodified E7 construct could be the increased translation and therefore an increased E7 protein expression. To prove this hypothesis, the modified E7 constructs has been analysed in transient transfection experiments (293T-cells). The comparison between immunisation and transfection experiments showed a clear correlation between increased protein expression in vitro and improved immunogenicity in vivo. But this is only true for the cellular and not for the humoral immune response ( similar low level in antibody response).