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Charakterisierung der Abspaltung und des Schicksals der Signalsequenz des Glykoproteins des lymphozytären Choriomeningitis Virus

Fröschke, Marc

English Title: Characterization of cleavage and fate of the lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein signal sequence

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PDF, German
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Abstract

Signalsequenzen (SS) für das Endoplasmatische Retikulum (ER) sind N-terminale Aminosäure-Sequenzen von naszierenden Membran- und sekretorischen Pre-Proteinen. Sie vermitteln den zielgerichteten Transport zum und die Translokation über die Membran des ER und sind daher sehr wichtig für die zelluläre Proteinsortierung. Die Signalsequenzen der meisten pre-Proteine werden kotranslational abgespaltet. Es wurde angenommen, daß sie anschließend sehr schnell abgebaut werden und daher keine weitere Funktion haben. In dieser Arbeit wurde die Abspaltung und das Schicksal der postulierten SS des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) Glykoproteins pGP-C (SSGP-C) untersucht. In einem zellfreien in vitro Translations-/Translokationssystem wurde ein Fusionsprotein, das aus der SSGP-C und dem reifen Teil des zellulären sekretorischen Proteins pre-Prolaktin besteht, nach dem zielgerichteten Transport über die ER Membran transloziert und die Signalsequenz abgespaltet. Somit handelt es sich bei den 58 N-terminalen Aminosäuren von pGP-C wirklich um eine Signalsequenz. Die Menge der abgespalteten SS war sowohl unter Verwendung dieses Fusionsproteins als auch eines verkürzten pGP-C sehr gering. Die abgespaltete Signalsequenz erwies sich aber entgegen der Annahme als überraschend stabil. Die Abspaltung der SSGP-C wurde weiterhin in vivo an kultivierten Zellen sowohl nach Transfektion mit einem pGP-C-Expressionsplasmid als auch nach Virus-Infektion untersucht. Nach radioaktiver Markierung der transfizierten oder infizierten Zellen konnte neben dem pre-Protein pGP-C auch die abgespaltete SS in großen Mengen nachgewiesen werden. Daher erfolgte die Abspaltung der SS in vivo nicht vollständig, aber zum überwiegenden Teil wahrscheinlich kotranslational. Sowohl das pGP-C als auch die SSGP-C waren überraschend stabil mit berechneten Halbwertzeiten von etwa 3 bzw. 6 Stunden. Diese hohe Stabilität von SSGP-C ist einmalig unter den bisher untersuchten Signalsequenzen. Wie erwartet war SSGP-C mit Membranen der Zelle assoziiert, wies aber eine ungewöhnliche Stabilität gegenüber Proteasen selbst nach Auflösung der Membranen unter nativen Bedingungen auf. Dies deutet darauf hin, daß beide hydrophoben Regionen der SSGP-C in der Membran verankert sind und die Signalsequenz wahrscheinlich eine äußerst stabile Konformation einnimmt. Die Signalsequenz des pGP-C besitzt zwei ungewöhnliche Eigenschaften. Sie ist im Vergleich zu zellulären Signalsequenzen sehr lang und enthält das immuno-dominante Epitop für zytotoxische T Lymphozyten (CTLs), durch die Virus-infizierte Zellen vom Immunsystem erkannt werden. Die hohe Stabilität der abgespalteten Signalsequenz könnte einen Einfluß auf die Freisetzung und anschließende Präsentation dieses CTL-Epitops haben. Dadurch könnte die Virus-Vermehrung unterstützt und die Überwachung durch das Immunsystem bei persistierender Infektion umgangen werden. Die möglichen wichtigen Funktionen des pre-Proteins pGP-C und der abgespalteten SS werden in dieser Arbeit diskutiert.

Translation of abstract (English)

Endoplasmic reticulum (ER) signal sequences are N-terminal extensions of nascent membrane and secretory pre-proteins. They mediate targeting to and translocation through the membrane of the ER and are therefore very important for cellular protein sorting. The signal sequences of most pre-proteins are cotranslationally cleaved off and are thought to be degraded rapidly afterwards. In this work the cleavage and fate of the postulated SS of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) glycoprotein pGP-C (SSGP-C) was investigated. In an in vitro translation and translocation system supplemented with rough microsomes we found that pGP-C is inserted into the membrane but its postulated signal sequence (SSGP-C) is only very inefficiently cleaved. By fusing the SSGP-C to the mature part of the cellular secretory protein pre-prolactin we could show that the N-terminal 58 amino acids of pGP-C are cleaved off the fusion protein and serve therefore really as a signal sequence. Surprisingly, the cleaved signal sequence is stable and not rapidly degraded as previously expected. After transfection of cells with a cDNA construct coding for pGP-C as well as after infection with LCMV both the cleaved signal sequence and the pGP-C accumulate during metabolic labeling. Therefore, the cleavage of the signal sequence was not complete but probably mainly cotranslational. Both pGP-C and the cleaved SSGP-C were quite stable with a calculated half-life of about 3 and 6 hours, respectively. This was very surprising and has not been found for any other signal sequence investigated so far. As expected, the cleaved SSGP-C was associated with membranes but showed an unusual stability against proteases even after solubilization of membranes with nonionic detergents. Therefore, both hydrophobic regions of the cleaved SSGP-C are probably anchored within membranes which lead to an tight conformation of the cleaved signal sequence. The pGP-C signal sequence has two unusual features. It is very long and bears an immuno-dominant cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitope by which virus infected cells are recognised by the host immune system. The high stability of the cleaved signal sequence might have an influence on the release and subsequent presentation of this CTL epitope. This could promote virus replication and help to escape immune surveillance during persistent infection. The possible important functions of pGP-C and the cleaved SSGP-C are discussed in this work.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dobberstein, Prof. Dr. Bernhard
Date of thesis defense: 18 January 2002
Date Deposited: 03 Dec 2003 07:12
Date: 2001
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteinbiosynthese, Translokation, Signalpeptide, Epitop, MHC Klasse I
Uncontrolled Keywords: Glykoprotein , Prozessierung , Antigenpräsentation , akute Virusinfektion , persistente Virusinfektionprotein targeting , signal sequence cleavage , CTL epitope , glycoprotein processing , viral infection
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