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Rekombinante Expression und vergleichende biochemische Charakterisierung der Isoformen C beta1 und C beta2 der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase

Gesellchen, Frank

English Title: Recombinant expression and biochemical characterisation of isoforms C beta1 and C beta2 of cAMP dependent protein kinase

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PDF, German
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Abstract

Die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) ist das Schlüsselenzym der cAMP-Signalübertragung. Im Ruhezustand bilden die Isoformen der regulatorischen (R) und katalytischen Untereinheiten (C) Heterotetramere, cAMP setzt daraus die aktiven C-Untereinheiten frei. Unser Wissen über die Funktion der C-Untereinheiten basiert fast ausschließlich auf Daten, die an C alpha erhoben wurden. Über die biochemischen Eigenschaften und die biologische Rolle der C beta-Isoform und ihrer Spleißvarianten ist nur sehr wenig bekannt. Völlig unklar ist bislang, ob und wie die C beta-Untereinheiten zur Weichenstellung in der cAMP-Signalkette beitragen können. Die Spleißvariante C beta2 unterscheidet sich von C beta1 im Exon 1 und ist mit 46 kDa die größte C-Untereinheit in Säugern. In dieser Arbeit konnte mit der Expression in Sf9-Zellen erstmals ein System etabliert werden, das es erlaubt, das C beta2-Protein katalytisch aktiv zu gewinnen und homogen zu reinigen. C beta2 wurde biochemisch mit den C alpha- und C beta1-Untereinheiten vergleichend charakterisiert. Dabei konnte bestätigt werden, dass C beta2 wesentliche Eigenschaften einer katalytischen Untereinheit der PKA aufweist. Allerdings unterscheiden sich die drei Isoformen signifikant in ihren katalytischen Konstanten - ein möglicher Ansatzpunkte für eine isoformabhängige Feinregulation der Signalweitergabe. Interaktionsanalysen mittels Oberflächenplasmonresonanz (SPR) zeigten erstmals, dass C beta1 und C beta2 mit allen Isoformen der R-Untereinheit assoziieren können. Verglichen mit C alpha weisen aber sowohl C beta1 als auch C beta2 verringerte Dissoziationsraten von den Untereinheiten RI alpha und RII alpha auf – dies könnte Konsequenzen für die Regulation der verschiedenen Isoformen in der Zelle haben. Weiterhin scheinen C alpha und C beta unterschiedliche Substrate zu bevorzugen. Während einige Substrate, wie z.B. CREB, unterschiedslos durch alle drei Isoformen phosphoryliert wurden, zeigte sich, dass das basische Myelinprotein und Histon H3 durch C beta1 und C beta2 deutlich geringer phosphoryliert werden als durch C alpha. Darüber hinaus konnte in Histonpräparationen eine inhibitorische Aktivität charakterisiert werden, die nur gegen C beta1 und C beta2, nicht aber gegen C alpha gerichtet ist. Sie weist Eigenschaften eines Proteins auf. Die Entdeckung eines solchen isoformspezifischen Inhibitors könnte der Schlüssel zu einem neuen Verständnis der spezifischen Signalweiterleitung sein. Es bleibt weiteren Arbeiten vorbehalten, zu klären, wie diese Regulation im zellulären Kontext stattfindet und weitere beteiligte Komponenten zu identifizieren. Zusammen mit der isoformspezifischen inhibitorischen Aktivität weisen die beobachtete Substratselektivität und die potentiell frühere Aktivierbarkeit und Abschaltung von C beta-Untereinheiten schon jetzt auf komplexe und vielfältige Möglichkeiten der Zelle hin, mit Hilfe der C beta Isoformen cAMP-Signale selektiv zu verarbeiten.

Translation of abstract (English)

The cAMP-dependent protein kinase (PKA) is the key enzyme in cAMP signalling. In its inactive state the isoforms of the regulatory (R) and catalytic (C) subunits form a heterotetramer, from which the active C-subunits are released by cAMP binding to the R-subunits. Our current knowledge on the function of C-subunits are almost exclusively based on data collected from the C alpha isoform. Very little is known however about the biochemical properties and the biological function of the C beta isoform and its splice variants. So far it has been completely unknown in which way the C beta-subunits might contribute to cAMP signalling. The C beta2 splice variant deviates from C beta1 in exon 1 and is the largest C-subunit in mammals with a molecular weight of 46 kDa. For the first time catalytically active C beta2-protein could be expressed and purified to homogeneity using baculovirus-infected Sf9 insect cells. C beta2 was then characterized biochemically in comparison to the C beta1- and C alpha-subunits. It could be confirmed that Cb2 possesses all the relevant properties of a catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. However, the three isoforms differed significantly in their catalytic constants – a possible indication of an isoform dependent fine-tuning of cAMP-signal transduction. Interaction analysis via surface plasmon resonance (SPR) showed for the first time that C beta1 and C beta2 are able to associate with all R-subunit isoforms. However, C beta1 and C beta2 exhibited lower dissociation rate constants from the RI alpha and RII alpha subunits compared to C alpha. This might have consequences for the regulation of different PKA isoforms in the cell. Furthermore, C alpha and C beta showed differences in substrate specificity. While some substrates, such as CREB, were phosphorylated equally well by all three isoforms, the myelin basic protein and histone H3 were phosphorylated to a lesser extent by C beta1 and C beta2. In addition, an inhibitory activity from histone preparations could be characterized, which was directed against C beta1 and C beta2 but not C alpha. This putative inhibitor showed characteristics of a protein. The discovery of such an isoform specific inhibitor could provide a key to a further understanding of isoform specific signal transduction. Further work in this field is required to elucidate this regulation in a cellular context and to identify the components involved. Already, the observed substrate selectivity, taken together with the differential regulation of C beta-subunits and the isoform specific inhibitory activity, point to complex and manifold possibilities of the cell to process cAMP-signals selectively with the aid of C beta-isoforms.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kübler, Dr. PD,re Dieter
Date of thesis defense: 7 October 2003
Date Deposited: 13 Jan 2004 11:00
Date: 2003
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteinkinase A, Protein-Serin-Threonin-Kinasen, Untereinheit, Enzymkinetik, Inhibitor, Rekombinantes Protein, Heterologe Genexpression
Uncontrolled Keywords: Spleißvariante , Oberflächenplasmonresonanz-SpektroskopiePKA , splice variant , reombinant expression , surface plasmon resonance , substrate specificity
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