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Modulation der Aktivität des nikotinischen Acetylcholinrezeptors in transgenen Tiermodellen

Peter, Jan Christoph

English Title: Modulation of the activity of the nicotinic acetylcholine receptor in transgenic animals

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PDF, German
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Abstract

Mutationen in den Untereinheiten des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (AChR) der neuromuskulären Synapse (NMJ) können zu Veränderungen der Rezeptoreigenschaften, wie der Ligandenbindung und/oder der Kanalöffnung führen. Die daraus resultierenden Veränderungen des Endplattenpotentials können zu congenitalen myasthenischen Syndromen (CMS) führen, die als Slow-Channel bzw. Fast-Channel Congenital Myasthenic Syndrome (SCCMS bzw. FCCMS) bezeichnet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei transgene Knock-In-Mauslinien etabliert. An der ersten Mauslinie (g/eFC) wurde der Einfluss untersucht, den die Aktivität des AChR auf die Etablierung der NMJ während der Embryonalentwicklung hat. In diesen Tieren trägt eine nur embryonal exprimierte Untereinheit des AChR eine Punktmutation, die den Austausch einer Aminosäure (P121L) bewirkt. Diese Mutation wurde in myasthenischen Patienten gefunden in denen sie das FCCMS auslöst. Elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass die Aktivität des AChR durch Einbau dieser mutierten Untereinheit drastisch reduziert wurde. Homozygote g/eFC-Tiere sterben bei der Geburt, die Etablierung und Lokalisierung der NMJ in der Muskelfaser sind gestört und das gerichtete Wachstum der Motorneurone ist nicht vorhanden. Diese Feststellungen belegen, dass die Aktivität des AChR für die korrekte Etablierung der postsynaptischen Seite der NMJ und das gerichtete Wachstum der Motoraxone verantwortlich ist. In einer zweiten Knock-In-Mauslinie (eSC) wurde eine Punktmutation in die postnatal exprimierte e-Untereinheit eingeführt, die ebenfalls den Austausch einer Aminosäure (L269F) bewirkt und im Menschen zum SCCMS führt. Homozygote eSC-Mäuse zeigen ab der zweiten Lebenswoche progressive myasthenische Symptome, wie reduzierte Kraft, reduziertes Körpergewicht und Veränderungen der Körperhaltung und Lautgebung. In diesen Tieren konnten massive degenerative Veränderungen der postsynaptischen Seite der NMJ und Muskelfaser festgestellt werden. Dazu gehören das Verschwinden postsynaptischer Einfaltungen, die Vergrößerung der Mitochondrien, subsynaptische Ansammlungen von Vesikeln und Vakuolen und Anzeichen degenerativer Prozesse der subsynaptischen Nuklei. Diese Veränderungen werden zusammengenommen als Endplattenmyopathie bezeichnet und konnten auch in Gewebe von SCCMS-Patienten festgestellt werden. Vermutlich werden sie durch massiv erhöhte Ca2+-Konzentrationen in der Muskelfaser ausgelöst. Neben der Endplattenmyopathie zeigten homozygote eSC-Mäusen, wie SCCMS-Patienten, eine Reduktion der AChR in der NMJ. Das SCCMS ist im Menschen eine dominant vererbte Krankheit, konnte dagegen aber nur in homozygoten eSC-Mäusen festgestellt werden. Die Gründe für die Unterschiede in der Vererbung konnten durch Kreuzungsexperimente geklärt werden. Dabei wurden eSC-Tiere mit Tieren einer anderen transgenen Mauslinie (eTet-Linie) gekreuzt, die nur eine reduzierte Expression der e-Untereinheit besitzt. Die Nachkommen aus diesen Kreuzungen zeigten myasthenische Symptome. Daraus folgt, dass die Unterschiede in der Vererbung mit der Expression des eSC-Allels zusammenhängt, das in heterozygoten eSC-Tieren schwächer exprimiert wird als das WT-Allel. Die Tiere der eSC-Linie können als Modellorganismus für SCCMS dienen. Mit ihrer Hilfe wird es möglich sein, in vivo neue Erkenntnisse über die physiologischen und genetischen Vorgänge, die bei der Entstehung von SCCMS eine Rolle spielen, zu sammeln. Möglicherweise ist auch eine Übertragung der Erkenntnisse auf neurodegenerative Krankheiten wie Epilepsie oder Schlaganfall möglich. Außerdem können sie durch genetische und morphologische Vergleiche mit anderen Mauslinien, in denen die Kanaleigenschaften des AChR verändert wurden, Aufschlüsse darüber geben, welchen Einfluss die Rezeptoraktivität auf die strukturelle und funktionelle Aufrechterhaltung der NMJ hat.

Translation of abstract (English)

Mutations in the subunits of the nicotinic acetylcholine receptor (AChR) of the neuromuscular junction (NMJ) can lead to changes of receptor properties, like effects on ligand binding and/or channel opening. The resulting changes of the endplate potentials can lead to congenital myasthenic syndromes (CMS), referred to as Slow-Channel or Fast-Channel Congenital Myasthenic Syndrome (SCCMS or FCCMS) respectively. In this work two lines of transgenic knock-in mice were established. In the first mouse line (g/eFC) the influence of the activity of the AChR on the establishment of the NMJ was examined. In these animals the g-subunit, that is expressed during embryogenesis, carries a point mutation, which provokes an amino acid exchange (P121L) and leads to FCCMS in myasthenic-patients. Electrophysiological examinations showed that the activity of the AChR was dramatically reduced by incorporation of this mutated subunit. Homozygous g/eFC-animals die during birth, the establishment and localisation of the NMJ are disturbed and the directed outgrowth of the motor-axon is absent. These results show that the activity of the AChR is needed for the correct establishment of the postsynaptic part of the NMJ and the directed outgrowth of the motor-axon. Another point mutation leading to an amino acid exchange (L269F) and provoking SCCMS in humans was introduced in the postnatally expressed e-subunit of a second line of knock-in mice (eSC). At two weeks of age homozygous eSC-mice show progressive myasthenic syndromes, like reduced strength, reduced body-weight and changes in posture and vocalisation. Massive degenerative changes were observed in the postsynaptic part of the NMJ and muscle-fibers of these animals. Among these is the loss of postsynaptic folds, the enlargement of mitochondria, subsynaptic accumulation of vesicles and vacuoles and signs of degeneration of subsynaptic nuclei. All together these changes are referred to as endplate-myopathy and are also observed in tissue from SCCMS-patients. Besides the endplate-myopathy, both homozygous eSC-mice and SCCMS-patients showed a reduction of AChR in the NMJ. In humans SCCMS is a dominantly inherited disease but could only be observed in homozygous eSC-mice. The reasons for this difference were clarified by breeding-experiments. eSC-animals were interbred with another transgenic mouse line (eTet), which shows a reduced expression of the e-subunit. The offspring showed myasthenic symptoms. This shows that the differences of the inheritance are due to the expression of the eSC-allele, which has a reduced expression in heterozygous eSC-animals compared to the WT-allele. Animals of the eSC-line can serve as a model organism for SCCMS. With their help it will be possible to gain new in vivo insights about physiological and genetic processes which play a role in the establishment of SCCMS. A transfer of these findings to neurodegenerative diseases like stroke or epilepsy may be possible. In addition genetic and morphological comparisons to other mouse-lines, in which the channel properties of the AChR have been changed, can give useful information about the influence of channel activity on structural and functional maintenance of the NMJ.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Pollerberg, Professor G. Elisabeth
Date of thesis defense: 19. December 2003
Date Deposited: 13. Jan 2004 14:07
Date: 2003
Faculties / Institutes: Service facilities > Max-Planck-Institute allgemein > MPI for Medical Research
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Motorische Endplatte, Myasthenie, Tiermodell, Transgene Tiere, Nicotinischer Acetylcholinrezeptor, Bewegungsapparat / Krankheit, Muskelfaser
Uncontrolled Keywords: Congenitale Myasthenie , Slow-Channel Congenitales Myasthenisches Syndrom , Fast-Channel Congenitales Myasthenisches Syndrom , Knock-Inneuromuscular junction , congenital myasthenic syndrome , transgene , nicotinic acetylcholine receptor , mutation
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