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Abstract

Das Gen der V-ATPase UE c1 aus der Zuckerrübe (Beta vulgaris) besitzt im Promotor und der 5’UTR je eine Polypyrimidinbox. Solche Motive aus sich häufenden TC-Alternierungen sind in pflanzlichen Promotoren und 5’UTRs ein häufig auftretendes Motiv mit bislang weitgehend ungeklärter Funktion. Am Beispiel des Promotors Y11037 des konstitutiv exprimierten V-ATPase c1 Gens wurden in dieser Arbeit gezeigt, dass die enthaltenen Polypyrimidin-Boxen ein funktional notwendiger Bestandteil des c1-Promotors sind. Die c1-Promotoraktivität fiel nach der Mutation der Polypyrimidin-Box1 (Box1 5’seitig der TATA-Box) um 95%, beziehungsweise nach Mutation der Polypyrimidin-Box2 (Box2 Position +44 – +63 in 5’UTR) um 37%. Weitere Versuche zeigten jedoch, dass allein die Existenz einer Polypyrimidin-Box nahe der TATA-Box nicht hinreichend ist um eine verstärkte Promotoraktivität zu gewährleisten. Es konnten aus Arabidopsis thaliana homologe Proteine des Polypyrimidin-bindenden Transkriptionsfaktors BBR aus der Gerste (Hordeum vulgare, Santi 2003) und Gbp aus der Sojabohne (Glycine max, Sangwan 2002) kloniert und aufgereinigt werden. Diese AtBR-Proteine mit einer stark homologen, jedoch bislang unbekannten DNA-, beziehungsweise Polypyrimidin-bindenden Domäne (Sangwan 2002) sind Vertreter einer gemeinsamen Familie von Transkriptionsaktivatoren. Für die AtBR-Transkriptionsfaktoren wurden zunächst die Voraussetzungen für eine spezifische Interaktion mit den Polypyrimidin-Boxen des c1-Promotors belegt. Eine subzelluläre Lokalisation eines N-terminalen GFP-AtBR1-Fusionsproteins ergab eine spezifische Akkumulation im Zellkern transient transformierter Beta vulgaris Zellsuspensionskultur. Zusätzlich konnte durch ein Cobombardment eines c1-Promotor-LUC-Konstrukts mit AtBR-Expressionsvektoren eine Aktivitätserhöhung des c1-Promotors in vivo festgestellt werden. Mittels Gelretentionsanalyse (EMSA) wurden in vitro für zwei AtBR-Transkriptionsfaktoren (AtBR1 und AtBR4) eine spezifische Interaktion mit den Polypyrimidin-Boxen des c1-Promotors nachgewiesen, wobei die Polypyrimidin-Box1 eine mindestens zweifach größere Affinität zu den AtBR-Transkriptionsfaktoren besitzt als die Polypyrimidin-Box2. Dieser Befund legt im Zusammenhang mit dem drastischen Aktivitätsverlust dach der Inaktivierung der Polypyrimidin-Box1 eine, in Abhängigkeit von der Bindeaffinität der AtBR-Transkriptionsfaktoren mit den Polypyrimidin-Motiven vorliegende Promotoraktivität (Transkriptionseffektivität) nahe. Weiterhin ergab ein in Arabidopsis-Pflanzen durchgeführtes Gen-Silencing für die AtBR-Transkriptionsfaktoren AtBR1, AtBR2 und AtBR3 erste Evidenzen für eine AtBR beeinflusste c1-Promotoraktivität. Alle Ergebnisse implizieren, dass die Frage nach der funktionalen Bedeutung von Polypyrimidin-Boxen und deren Rolle als Bindemotiv in den Promotoren und 5’UTRs sich durch eine Interaktion von Vertretern der Proteinfamilie der AtBR-Transriptionsfaktoren erklärt. Der wirtschaftliche Einsatz des c1-Promotors oder allgemein von Promotorsequenzen mit Polypyrimidin-Motiven zur Expression von Nutzgenen in transgenen Pflanzen muss die Zusammenhänge durch die Wechselwirkung von AtBR-Transkriptionsfaktoren für den gezielten Einsatz berücksichtigen. Weitere Grundlagenforschung, insbesondere die Suche nach mit AtBR interagierenden Proteinen und die Bedeutung der einzelnen AtBR-Isoformen, sind für ein tieferes Verständnis unerlässlich.

Translation of abstract (English)

The gene encoding the V-ATPase subunit c1 from sugar beet (Beta vulgaris) includes polypyrimidine-boxes in the promoter region (Box 1) and in the 5’UTR (Box 2), respectively. Such sequence motives are frequently found in plant promoters and 5’UTRs, but their function(s) remain so far largely unknown. For the promoter of the constitutively expressed V-ATPase c1 gene (Y11037) it was shown in this work that the polypyrimidine-boxes 1 & 2 are functionally important components of the c1 gene. For the c1 promoter, a 95% decrease of activity was observed when the polypyrimidine-box 1 was mutated (Box 1: immediately 5’upstream of the TATA-box), whereas mutation of box 2, located in the 5'UTR caused a 37% decrease of reportergene activity (Box 2 position +44 - +63 in 5’UTR). However, further experiments demonstrated that introducing a box 1-sequence motif into an unrelated promoter close to the TATA box did not per se increase promoter activity. Arabidopsis thaliana homologs of the polypyrimidine binding transcription factors BBR from barley (Hordeum vulgare; Santi 2003) and Gbp from soybean (Glycine max; Sangwan 2002) were cloned and expressed as recombinant proteins in E.coli. These so called AtBR proteins contain a highly conserved, previously unknown polypyrimidine tract binding domain (Sangwan 2002) and are representatives of a larger family of transcription activators. First, the conditions for AtBR transcription factor binding to the polypyrimidine-boxes of the c1 promoter were analysed. The subcellular compartmentation of an N-terminal GFP::AtBR1-fusion protein as analyzed by transient transformation of Beta vulgaris suspension-cultured cells indicated exclusive nuclear localization. Second, cobombardment of a c1-promotor::luciferase construct with an AtBR1 expression vector resulted in an increase of c1 promoter activity in vivo. By means of electrophoretic mobility shift assay (EMSA), a specific interaction of two AtBR-transcription factors (AtBR1 and AtBR4) with the polypyrimidine-boxes of the c1 promoter was demonstrated. Here, the AtBR-transcription factors showed a preferential binding to polypyrimidine-box 1 as compared with polypyrimidine-box 2. These observations suggest that the promoter activity of the c1 gene is most likely under the control of AtBR transcription factors via binding to the polypyrimidine-motives. Finally, RNAi-mediated silencing of AtBR expression (AtBR1, AtBR2 and AtBR3) in Arabidopsis provided preliminary evidence for an AtBR affect on c1 promoter activity in planta. In summary, the results presented here strongly support the hypothesis that binding of AtBR proteins to polypyrimidine boxes in the promoter regions and/or 5'UTR of plant genes may affect gene expression. Any biotechnological application of the c1 promoter, or, more generally, of promoter sequences with polypyrimidine-motives to express genes of interest in transgenic crop plants must consider the effects of AtBR-like transcription factors on promoter activity. Further basic research, in particular the search for proteins interacting with AtBR and elucidating the roles of individual AtBR isoforms, will be required to properly address the biological significance of this novel transacription factor family.