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Abstract

Verfahren zur gezielten Beeinflussung intrazellulärer Vorgänge sind heute hauptsächlich auf rekombinante genetische Methoden beschränkt. Diese sind jedoch mit zahlreichen Limitierungen verbunden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte daher eine neue Klasse von makromolekularen Modulatoren mit therapeutischem Potential entwickelt werden. Diese Modulatoren sollten zum einen die Fähigkeit besitzen, spezifisch an ihre Zielzellen zu binden, andererseits aber auch effektiv an ihren intrazellulären Wirkort gelangen können. Erreicht wurde dies durch die Generie-rung modularer Multidomänenproteine, welche sämtliche für ein effizientes intrazelluläres Targeting erforderlichen Funktionen in einer einzigen Polypeptidkette vereinigen. Das als �Ligand Sneaking� bezeichnete Verfahren wurde modellhaft für die Interaktion mit Schlüsselstellen der NF-kappaB-Signalkaskade entwickelt. Ein anti-Transferrinrezeptor single chain Antikörper-fragment (aTFR-scFv) diente dabei der Zielzellerkennung und Internalisierung der Fusions-proteine. Für die Translokation in das Cytoplasma wurde die Endosomen-escape-Domäne des Exotoxins A aus dem Bakterium Pseudomonas aeruginosa verwendet. Verschiedene Peptid-liganden kamen als spezifische Modulatoren für die Interaktion mit der NF-kappaB-Signalkaskade zum Einsatz. Die einzelnen funktionellen Domänen wurden mittels PCR amplifiziert und in den Vektoren pOPE101 bzw. pHOG21 kombiniert. Nach der Expression in E. coli und der affinitäts-chromatographischen Aufreinigung aus periplasmatischen Extrakten konnte die Identität der Fusionsproteine im Western Blot bestätigt werden. In einer ELISA-Bindungsstudie wurde die spezifische Bindung an den Transferrinrezeptor belegt. Mit Hilfe konfokalmikroskopischer Ana-lysen konnte ausserdem gezeigt werden, dass Ligand Sneaking-Fusionsproteine über rezeptor-vermittelte Endozytose von ihren Zielzellen aufgenommen wurden. Die intrazelluläre Verteilung der Proteine wurde in verschiedenen Kolokalisationsexperimenten untersucht. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die interne Translokationsdomäne aus Pseudomonas im Kontext der Fusionsproteine funktionell ist und den Übertritt der Modulatoren in das Cytoplasma vermittelt. Mit Hilfe eines NF-kappaB-Reporter Assays konnte das NF-kappaB-inhibierende Potential der dargestellten Fusionsproteine demonstriert werden. Für einen potentiellen Austausch des Targeting-Antikörpers wurde zusätzlich ein scFv-Fragment gegen das Nierenzellkarzinom-spezifische G250-Tumorantigen aus einer Hybridomzellinie isoliert und charakterisiert. Dieses Antigen wird nach Ligandenbindung internalisiert und stellt somit ein geeignetes Zielmolekül für die Behandlung von Nierenzellkarzinomen im Rahmen eines Ligand Sneaking-Ansatzes dar. Durch seine Universalität bietet das Ligand Sneaking-Prinzip die Chance zur Entwicklung einer völlig neuen Klasse von Therapeutika, die durch ihre hochspezifische Wirkungsweise eine neue Dimension pharmakologischer Selektivität erreichen.

Translation of abstract (English)

The ability to specifically modulate intracellular processes is largely limited to recombinant genetic approaches. This study describes the development of a novel class of macromolecular modulators with therapeutic potential. These molecules should specifically bind to their target cells and be effectively delivered to their intracellular place of action. This task was accomplished by generating modular fusion proteins, which combine all functions required for an efficient intracellular targeting in a single polypetide chain. The principle, termed Ligand Sneaking, was developed as a model concept for interaction with key sites of the NF-kappaB signal cascade. An anti-transferrin receptor single chain Fv (aTFR-scFv) antibody fragment was used for specific cell targeting and internalization of the fusion proteins. Translocation to the cytosol was mediated by introducing the Pseudomonas aeruginosa exotoxin A endosome escape domain into the fusion proteins. Several different peptide ligands were employed for the interaction with the NF-kappaB signal cascade. All functional domains were PCR-amplified and combined in the expression vectors pOPE101 and pHOG21. After production in E. coli and purification from periplasmic extracts, the identity of the proteins could be confirmed by western blotting. Specific binding to the transferrin receptor antigen was observed in a competitive ELISA binding assay. Uptake of the Ligand Sneaking fusion proteins by receptor-mediated endocytosis could be seen with confocal microscopy. Intracellular localization of the proteins was assessed by colocalization experiments with the natural TFR ligand transferrin. Furthermore, functionality of the internal Pseudomonas translocation domain as well as translocation of the modulator into the cytosol was observed. Based on transfection experiments with a NF-kappaB luciferase reporter, the NF-kappaB inhibiting potential of Ligand Sneaking fusion proteins could be demonstrated. For the potential replacement of the targeting antibody fragment, a scFv antibody directed against the renal cell carcinoma-specific G250 tumor antigen was isolated from a hybridoma cell line and functionally characterized. Since this antigen is known to internalize, it could be used as a target for the treatment of renal cell carcinomas based on the Ligand Sneaking method. Through its universality, Ligand Sneaking offers the chance for the development of a novel class of protein-based therapeutics, thereby reaching a new dimension of pharmacological selectivity.