German Title: Die Rolle des Adapterproteins MecA in der Regulation des AAA+ Chaperons ClpC aus Bacillus subtilis

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Abstract

ClpC, a member of the AAA+ protein superfamily from Bacillus subtilis, is forming with ClpP a proteolytic system, that is part of the protein quality control system and involved in general proteolysis of misfolded and aggregated proteins. In addition ClpCP together with the adaptor MecA is necessary for the regulated proteolysis of the transcription factor ComK in competence development of B. subtilis. The ClpCP mediated regulatory proteolysis controls also stress response and sporulation in B. subtilis. In this work the in vitro chaperone activity of ClpC was investigated. It was discovered that the presence of the adaptor protein MecA is essential for the chaperone activity of ClpC, because it targets substrate to ClpC and activates ClpC by assisting the oligomerisation of ClpC. In particular MecA enabled ClpC to disaggregate and refold previously heat aggregated Luciferase and Malate Dehydrogenase. In the presence of ClpP, MecA enabled the subsequent degradation of unfolded or previously heat-aggregated proteins by ClpCP while native proteins were not degraded. In addition it was demonstrated that the MecA paralogue YpbH, which is not involved in the regulatory proteolysis in B. subtilis, displayed comparable chaperone activities. Therefore MecA and YpbH may have a general and complementary function in protein quality control. These and other experiments suggested that MecA can coordinate substrate targeting with ClpC activation and that the ATPase induction of ClpC by MecA was necessary but not sufficient for this activation. The question why MecA is necessary for the general activation of ClpC was addressed in more detail. It could be demonstrated that in the presence of ATP MecA assists the assembly of an active higher oligomer of ClpC via formation of a ClpC-MecA heterodimer. This higher oligomeric complex is a prerequisite for all the activities of AAA+ proteins and consists presumably of a hexamer of ClpC interacting with up to six MecA molecules. The N-terminal and the Linker domain of the first AAA+ domain of ClpC were identified as MecA interaction sites and structural determinants necessary for this process. Controlling the ability of an AAA+ protein to form an active ring is an important functional aspect by which the activity of this protein family can be specifically regulated by an adaptor protein.

Translation of abstract (German)

ClpC, ein Protein der AAA+-Superfamilie aus Bacillus subtilis, ist zusammen mit ClpP ein Teil der zellulären Protein-Qualitätskontrolle und für die generelle Proteolyse von missgefalteten und aggregierten Proteinen zuständig. ClpCP ist außerdem wichtig für die gerichtete Degradation von regulatorischen Proteinen, welche die Stressantwort, die Sporulation und die Kompetenzentwicklung in B. subtilis kontrollieren. Der genaue Mechanismus dieser Regulation konnte für die Kompetenzentwicklung genauer untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Adaptorprotein MecA notwendig ist, um zusammen mit ClpCP den Transkriptionsfaktor ComK der Kompetenzentwicklung in B. subtilis gezielt zu degradieren, und dass MecA gleichzeitig die ATP-Hydrolyse von ClpC stimuliert. In dieser Arbeit wurden die in vitro Chaperon-Eigenschaften von ClpC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit des Adaptorproteins MecA essentiell für die ATPase und die Chaperon-Aktivität von ClpC ist. Diese Arbeit legt dar, dass MecA die Disaggregation und Rückfaltung der hitzeaggregierten Modellsubstrate Luciferase und Malatdehydrogenase durch ClpC ermöglicht. Weiterhin ermöglicht MecA auch die Degradation von ungefalteten und aggregierten Proteinen durch ClpCP. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass das MecA-Paralog YpbH, welches nicht an der regulierten Proteolyse in B. subtilis beteiligt ist, mit MecA vergleichbare Chaperon-Aktivitäten besitzt. Daher können MecA und YpbH generelle und komplementäre Funktionen in der Protein-Qualitätskontrolle haben. Diese Experimente schlagen eine durch MecA koordinierte Substrat-Erkennung und ClpC-Aktivierung vor, für welche die ATPase-Aktivität von ClpC zwar notwendig aber nicht allein ausreichend ist. Der Mechanismus der generellen Aktivierung von ClpC durch MecA wurde genauer untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass ClpC ohne Adaptor ein inaktives Monomer ist, welches durch Zugabe von MecA über ein Heterodimer in Anwesenheit von ATP zu einem aktiven hexameren Komplex oligomerisiert wird. Weitere Experimente zeigten, dass für die Interaktion von ClpC mit MecA die N- und die Linker-Domäne notwendig sind. Die Kontrolle der Ringbildung und somit der ATPase- und Chaperon-Aktivität von ClpC durch ein Adaptorprotein stellt einen neuen Kontrollmechanismus von AAA+-Proteinen dar.