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Pseudovirionen zur Simulation von Infektionen mit humanpathogenen Papillomaviren

Peiler, Tanja

English Title: Pseudovirions to Simulate Infections with Human Papillomaviruses

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PDF, German
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Abstract

Da es bislang kein effizientes in vitro-Replikationssystem für Papillomaviren gibt, sind viele molekulare Aspekte der Infektion noch unklar. Mit Hilfe von Pseudovirionen, die sich aus einem Kapsid und einem assoziierten Plasmid mit Reportergen zusammensetzen, können anhand dessen Expression eine erfolgreiche "Infektion" von Zielzellen detektiert und somit frühe Infektionsereignisse simuliert werden. Rossi et al. (2000) entwickelten ein vielversprechendes Produktionssystem in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, bei dem jedoch langfristig erhebliche Schwankungen bei der Ausbeute auftraten und zuletzt keine infektiösen Pseudovirionen mehr generiert werden konnten. In dieser Arbeit konnten mit dem Hefe-Produktionssystem zwar HPV16 L1/L2 VLPs isoliert werden, die auch teilweise mit dem EGFP-Zielplasmid assoziiert waren, doch konnte keine Pseudoinfektion von Zielzellen nachgewiesen werden. Mögliche Gründe für das Scheitern der Pseudovirionenproduktion in Hefe sind eine mangelhafte Verpackung des Reporterplasmids in die Partikel, ein Verlust der Infektiosität (z.B. durch die Aggregation mit zellulären Komponenten) oder eine zu geringe, nicht detektierbare Transgenexpression. Um dennoch Pseudoinfektionsexperimente durchführen zu können, wurden mittels der in vitro Disassembly/Reassembly-Methode nach Kawana et al. (1998) aus in Insektenzellen produzierten HPV16 L1/L2 VLPs und einem EGFP-Reporterplasmid infektiöse Pseudovirionen konstruiert. Das Zerfallen der VLPs in Kapsomere und die erneute Zusammenlagerung in Gegenwart von Reporterplasmid wurde mittels Elektronenmikroskopie und Sedimentationsanalysen dokumentiert. Nach Inkubation von Zielzellen mit Disassembly/Reassembly-Material konnte ein partikelabhängiger Gentransfer nachgewiesen werden: Die Infektiosität fand sich in Partikelfraktionen, und durch die Hitzeinaktivierung oder die Präinkubation des Disassembly/Reassembly-Materials mit spezifischen neutralisierenden Antikörpern bzw. mit Heparin wurde der Gentransfer blockiert. Das Reporterplasmid scheint nur partiell enkapsidiert oder äußerlich mit dem Partikel assoziiert zu sein, denn es war nicht vor DNasen geschützt. Die Pseudoinfektion folgte einer one-hit-Kinetik. Es konnten Zelllinien verschiedener Spezies und Ursprungsgewebe pseudoinfiziert werden. Dabei schien die SV40 ori-Replikation des Reporterplasmids in der Zielzelle erforderlich für eine effiziente Detektion der Pseudoinfektion. HPV16 L1-Pseudovirionen in der Abwesenheit von L2 konnten ebenfalls konstruiert werden, zeigten aber eine verminderte Infektiosität. Auch VLPs, die lediglich mit dem Reporterplasmid koinkubiert wurden, waren zum Gentransfer befähigt. Die Plasmidkonformation (superhelikal, relaxiert oder linear) beeinflusste die Schwebedichte, nicht aber die Effizienz des Gentransfers, das Sedimentationsverhalten oder die DNase-Sensitivität der Pseudovirionen. Nur bei mit zirkulären Plasmid durch Disassembly/Reassembly hergestellten Pseudovirionen resultierte eine im Vergleich zu VLPs erhöhte Schwebedichte, nicht aber bei linearem Plasmid oder einer bloßen Koinkubation mit zirkulärem Plasmid. Auch wenn das Reporterplasmid nicht vollständig enkapsidiert vorliegt, konnte mit den durch in vitro-Disassembly/Reassembly konstruierten Pseudovirionen ein partikelvermittelter Gentransfer in Zielzellen verschiedenen Ursprungs erzielt werden. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, dieses System für Studien z.B. zur Papillomavirusinfektion einzusetzen

Translation of abstract (English)

Since there is no efficient in vitro replication system for papillomaviruses yet available, many molecular aspects of infection remain unclear. Pseudovirions are particles consisting of a capsid associated with a reporter gene. By monitoring reporter gene expression, successful pseudoinfection of target cells can be detected, allowing for the simulation of early infection events. Rossi et al. (2000) developed a promising production system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. But over time, substantial variations in yield occured, and finally pseudovirion production was lost entirely. Although in this thesis HPV16 L1/L2 VLPs, which were partially associated with the EGFP target plasmid, could be isolated from the yeast production system, no pseudoinfection of target cells could be detected. Possible reasons for the failure of pseudovirion production are insufficient packaging of the reporter plasmid into the particle, loss of infectivity (e.g. through aggregation with cellular components), or transgene expression too low to be detectable. In order to still be able to conduct pseudoinfection experiments, infectious pseudovirions were constructed by the in vitro disassembly/reassembly method described by Kawana et al. (1998), using HPV16 L1/L2 VLPs produced in insect cells and an EGFP reporter plasmid. The dissocation of VLPs into capsomers and the reassembly in the presence of reporter plasmid was documented by electron microscopy and sedimentation analysis. Following incubation of target cells with disassembly/reassembly material, a particle-mediated gene transfer could be detected: Infectivity was found in particle-containing fractions, and heat inactivation or preincubation of disassembly/reassembly material with specific neutralizing antibodies as well as heparin blocked gene transfer. The reporter plasmid seems to be partially encapsidated or externally attached to the particle, since it was not protected from DNase treatment. Pseudoinfection followed a one-hit kinetics. Cell lines of different species and tissue origin could be pseudoinfected. Apparently, SV40 ori replication of the reporter plasmid in the target cell was required for efficient detection of pseudoinfection. HPV16 L1 pseudovirions could be generated in the absence of L2, but exhibited reduced infectivity. VLPs only coincubated with the reporter plasmid were also capable of gene transfer. Plasmid conformation (supercoiled, relaxed or linear) influenced buoyant density, but not gene transfer efficiency, sedimentation or DNase-sensitivity of pseudovirions. Only when circular plasmid was used in disassembly/reassembly, buoyant density was higher than that of VLPs. This was not the case for linear plasmid or coincubation with circular plasmid. Although the reporter plasmid is not completely packaged, particle-mediated gene transfer into target cells of different origin could be achieved with pseudovirions constructed by in vitro disassembly/reassembly. Thus, this system could be applied in studies on e.g. papillomavirus infection.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gissmann, Prof. Dr. Lutz
Date of thesis defense: 29. July 2004
Date Deposited: 03. Aug 2004 13:31
Date: 2004
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Papillomaviren, Saccharomyces cerevisiae, Tropismus, Capsid
Uncontrolled Keywords: Pseudovirionen , Pseudoinfektion , HPV
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