German Title: Studien zur zellbiologischen Funktion der Amyloid Vorläufer Protein (APP) Familie in Drosophila melanogaster und Säugern

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Abstract

Alzheimer�s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder affecting cognitive functions of the brain, and is pathologically characterized by extracellular Amyloid plaques and intracellular neurofibrillary tangles are the main pathological features of AD. Amyloid-beta, the main protein constituent of Amyloid plaques, is derived from the Amyloid Precursor Protein (APP) by proteolytic processing. APP is a type I transmembrane protein, which resembles a cell surface receptor, and consists of a large ectodomain and a short cytoplasmic tail. While Abeta generation from APP is well investigated, the physiological function of APP is still incompletely understood. Nevertheless, a diverse set of APP functions has been proposed, including cell-cell and cell-matrix interactions and intracellular signalling. In this study, the cell adhesion properties of APP and its mammalian paralogues, APLP1 and APLP2, were investigated in vivo and in vitro. Using Drosophila melanogaster as a model system, it has been shown that expression of APP, APLP1, or APLP2 in the Drosophila wing leads to cell adhesion defects, which was evident from detached cell layers and incomplete wing development. It was further revealed that the induced, so called blistered wing phenotype depends on the extracellular domain and membrane anchoring of APP, and the phenotype is additionally modulated by proteolytic conversion of APP. Interestingly, the most pronounced defects in wing development were caused by overexpression of APLP2, which were shown to be caused by interference of APLP2 with Wingless signaling via genetic interaction with the Drosophila Glypican Dally. Furthermore, using the Drosophila model organism, genetic interactions of the APP intracellular domain with two novel putative interaction partners, Numb and Disabled-2, were identified. The interacting domain of APP was mapped, and binding was verified by biochemical analysis. The results obtained with the Drosophila model system for cell adhesion properties of APP family proteins were extended to an in vitro cell aggregation assay, where APP, APLP1, or APLP2 were shown to mediate homo- and heterotypic cell interaction. The intercellular interaction of APP family proteins is highly specific, as a mutant of APP lacking the extracellular domain failed to promote cell clustering. These data strongly suggest that APP family proteins form trans-dimers and contribute to cellular interactions via formation of homo- and heterotypic, trans-cellular complexes. Interestingly, the in vivo phenotype strength induced by APP family proteins in Drosophila correlates with the cell aggregation data, suggesting that trans-cellular interaction of APP family proteins is crucial for both phenomena. Additionally, APLP1 and APLP2 were shown to mediate cellular uptake of their corresponding secreted fragments, supporting a hitherto not observed receptor-like function. Moreover, a genetic interdependence and molecular interaction of APP and APLP1 in synaptically enriched membrane compartments was found in this study, corroborating a functional role for APP family proteins in the connectivity of pre- and postsynaptic membranes. Taken together, previously not described homo- and hetero-trans-dimerization of APP family proteins seems to be involved in cell adhesion and represents an important feature required for their physiological function.

Translation of abstract (German)

Alzheimer ist die am häufigsten auftretende neurodegenerative Erkrankung und führt zum zunehmenden Verlust kognitiver Fähigkeiten. Pathologisch ist die Krankheit durch extrazelluläre Amyloide Plaques und intrazelluläre Neurofibrillenbündel (NFTs) charakterisiert, welche als Ablagerungen im Gehirn auftreten. Der Hauptproteinbestandteil der Plaques ist das Amyloid-beta Peptid, welches durch proteolytische Spaltung des Vorläuferproteins APP (�Amyloid Precursor Protein�) entsteht. APP ist ein Typ I Transmembranprotein mit Ähnlichkeit zu Zelloberflächenrezeptoren, und besteht aus einer großen extrazellulären, einer Transmembran- und einer kurzen zytoplasmatischen Domäne. Obwohl die Abeta-Entstehung aus APP und dessen pathologische Relevanz sehr gut untersucht sind, ist die physiologische Funktion von APP weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften von APP und den humanen Paralogen, APLP1 und APLP2, in Bezug auf Zelladhäsion untersucht. Hierzu wurde zum einen die Fruchtfliege Drosophila melanogaster als Modellsystem benutzt. Es wurde gezeigt, dass die Expression von APP, APLP1 und APLP2 während der Flügelentwicklung zu Zelladhäsionsdefekten führt. Dies konnte durch unvollständige Flügelentwicklung und Blasenbildung (�blistered wing� Phänotyp) durch Verlust von Zelladhäsion beobachtet werden. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Ektodomäne und die Membranverankerung von APP zur Erzeugung des Phänotyps notwendig sind. Außerdem wurden die Zelladhäsionsdefekte durch eine Prozessierungs-defiziente APP Mutante (APP-M596I/F615P) deutlich verstärkt. Für APLP2 konnte gezeigt werden, dass es während der Flügelentwicklung mit dem Wingless-Signalweg interferiert, indem es mit dem Zelloberflächen-Glypican Dally interagiert. Basierend auf genetischen Interaktionsanalysen in Drosophila, konnte nachfolgend in vitro und in vivo gezeigt werden, dass die Adapterproteine Numb und Disabled 2 an das zytoplasmatische NPTY-Motiv der APP Genfamilie binden können. Die Zelladhäsionseigenschaften der APP Gen-Familie wurden zum anderen auch in einem zellulären System untersucht. Durch Zellaggregation konnte gezeigt werden, dass APP, APLP1 und APLP2 homo- und heterophil interagieren können. Diese Ergebnisse lassen auf eine spezifische und direkte interzelluläre trans-Dimerisierung der APP Genfamillie schließen, da ein APP Konstrukt ohne Ektodomäne keine Zellaggregation verursachte. Auffälligerweise korreliert die Stärke des Zelladhäsionsphänotyps in Drosophila mit den Zellaggregationseigenschaften der APP Genfamillie, was auf einen Zusammenhang beider Phänomene mit der trans-Interaktion von APP, APLP1 und APLP2 hindeutet. Weiterhin wurde eine Rezeptorfunktion für APLP1 und APLP2 beschrieben, da beide Proteine die zelluläre Aufnahme ihrer eigenen sekretorischen Fragmente vermitteln. Im Mausmodell wurde die Interaktion zwischen APP und APLP1 bestätigt, und es konnte eine Interaktion der beiden Proteine in synaptischen Kompartimenten gezeigt werden. Da zudem die APLP1 Proteinmenge in APP �knock out�-Mäusen erhöht ist, kann auf eine gemeinsame Funktion während der Synaptogenese geschlossen werden. Zusammenfassend stellt die hier erstmalig beschriebene homo- und hetero-trans-Dimerisierung der APP Genfamillie eine wichtigen funktionelle Eigenschaft dieser Proteine dar, welche für Zelladhäsion physiologisch relevant sein könnte.