English Title: Proteinanalysis for the characterisation of stages of the life cycle of Stigmatella aurantiaca

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Abstract

Um Veränderungen im Proteom während der unterschiedlichen Wachstums- und Entwicklungsphasen des Prokaryonten Stigmatella aurantiaca zu detektieren, wurden Proteinextrakte, die aus Zellen verschiedener Lebenszustände stammen, in einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D) aufgetrennt. Tatsächlich änderten sich die Protein-Muster während der Entwicklung zum Fruchtkörper bemerkenswert. Proteinspots erscheinen und verschwinden, was auf eine entwicklungsspezifische Synthese und Degradierung von Polypeptiden schließen läßt. Eine Charakterisierung und Identifizierung dieser Polypeptide erfolgte durch die Massenspektrometrie. Partielle Sequenzen (bis zu 10 Aminosäuren), abge-leitet aus dem massenspektrometrischen Fragmentierungsmuster, wurden mit Polypeptidsequenzen in Protein-Bibliotheken verglichen. Diese Analyse resultiert in einer Zuweisung zu bestimmten bekannten Proteinen. Auf diese Weise können Polypeptide, spezifisch für vegetative Zellen, Sporen aus Indol-behandelten Zellen oder Fruchtkörper analysiert werden. Ein Protein konnte als der Elongationsfaktor TU, ein anderes als die verzweigte Kette der b-Untereinheit der Oxocarbonsäure Dehydrogenase (E1) von S. aurantiaca bestimmt werden. Eine weitere Homologie besteht zu einer ATP-abhängigen Clp Protease (Homolog CD4A der ATP-bindenden Untereinheit ClpA�s) von Lycopersicon esculentum, der Tomate, einem Eukaryont. Somit könnte auch bei S. aurantiaca eine Proteolyse von Proteinen durch das clp-System stattfinden. Für die Isolierung hochmolekularer Proteasen, die wahrscheinlich an der Entwicklung beteiligt sind, wurden Zelllysate verschiedener Wachstums- und Entwicklungsstadien von S. aurantiaca mittels einer Sucrosedichtegradienten-Zentrifugation fraktioniert. Die Enzymaktivität wurde mit einem proteasom-spezifischen Substrat bestimmt, während die übliche proteolytische Aktivität von Serin-, Aspartatsäure-, Thio- und Metalloproteasen gehemmt wurde. Das tatsächlich proteasomale Aktivität vorhanden ist, wurde durch die Verwendung eines spezifischen Antiserums gegen die 20S Untereinheit des Proteasoms des Archaea Thermoplasma acidophilum bestätigt. Die Verteilung der Enzymaktivität über den Sucrosedichtegradienten läßt den Schluß zu, daß S. aurantiaca hochmolekulare Proteasen beherbergt. Diese könnten für die Degradierung von Polypeptiden während des Entwicklungszyklus verantwortlich sein. Eine An-reicherung und Reinigung vermeintlicher hochmolekularer Proteasen wurde durch verschiedene chromatographische Verfahren erreicht. Fraktionen mit einer möglichen Proteasomaktivität wurden mittels 2D analysiert. Die bis jetzt gewonnen Daten weisen darauf hin, daß Proteine mit einer proteasomalen Funktion/Aktivität vorhanden sind, die am Entwicklungszyklus von S. aurantiaca beteiligt sind.

Translation of abstract (English)

To detect changes in the proteome during different growth and developmental stages of the prokaryote Stigmatella aurantiaca, protein extracts obtained from cells in different developmental stages were subjected to two-dimensional electrophoresis (2D). Indeed, protein patterns during development were remarkably changing. Protein spots appear and disappear suggesting development-specific synthesis and degradation of polypeptides. For the characterisation and identification of these appearing and disappearing polypeptides, protein spots obtained by 2D were proteolyzed and subjected to mass spectrometry (MS). Partial sequences (up to 10 amino acids) deduced from the MS fragmentation pattern were compared with polypeptide sequences from protein libraries. This assists with the assignment to certain known proteins. In this way polypeptides specific for vegetative cells, indol-induced spores or fruiting bodies were analysed. One protein spot could be determined as the elongation factor TU, another one as the branched chain b-subunit of the keto acid dehydrogenase (E1) of S. aurantiaca. Another homolog was identified having similarity to an ATP-dependent Clp protease (homolog of the ATP-binding subunit of Clp A) of Lycopersicon esculentum, the tomato, an eukaryote. This suggets that proteolysis of proteins could proceed via the clp-system in S. aurantiaca. For the isolation of high molecular weight proteases that may be involved in development cell lysates from various growth and developmental stages of S. aurantiaca were subjected to sucrose gradient centrifugation. The proteasomal activity was determined using a proteasome-specific substrate, while the usual protease activities of serine-, aspartic acid-, thio- and metalloproteases were inhibited. A specific antiserum against the 20S subunit of the proteasome of the archae Thermoplasma acidophilum was used to approve the existence of proteasomal activity. The distribution of enzyme activity over the sucrose gradient suggests that S. aurantiaca harbours high molecular weight proteases. These might be responsible for the degradation of polypeptides during development. Further enrichment and purification of putative high molecular weight proteases was performed by various chromatography procedures. Fractions with a putative proteasome activity were analysed further by 2D and Data obtained so far suggest that proteins with proteasomal function/activity are present that might be related to S. aurantiaca development.