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Entwicklung eines DNA Microarrays zur genomweiten Analyse Polycomb-vermittelter Genregulation in Drosophila melanogaster

Koch, Britta

English Title: Development of a DNA Microarray for the genome-wide analysis of Poycomb-mediated gene regulation in Drosophila melanogaster

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Abstract

Durch die Sequenzierungsprojekte der letzten Jahre konnte eine eindrucksvolle Menge an Daten über die Anzahl und Struktur der Gene sowie über die strukturelle und funktionelle Organisation von Genomen angesammelt werden. Diese Informationen bilden die Grundlage für Projekte, die es in Zukunft ermöglichen werden, die Rolle jeden Gens innerhalb des komplexen Zusammenspiels der Gene im lebenden System zu erforschen. Eine Methode, die auf solche Fragestellungen ausgerichtet ist, nutzt DNA Microarrays. Mit ihrer Hilfe kann die Expression von Genen eines gesamten Genoms zu bestimmten Zeitpunkten oder in verschiedenen Geweben untersucht werden. Auch epigenetische Mechanismen der Regulation können mit einem solchen System untersucht werden. Zwei Gruppen von Genen, die eine wichtige Rolle in diesem als �zelluläres Gedächtnis� bezeichneten Prozess spielen, sind die Polycomb-Gruppe und die trithorax-Gruppe. Während die trithorax- Gruppe die Aufgabe erfüllt, das Expressionsmuster von aktiven Genen während der Entwicklung aufrecht zu erhalten, kommt der Polycomb-Gruppe die Aufgabe zu, den reprimierten Zustand von Genen über viele Zellteilungen sicherzustellen. Innerhalb dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Microarraytechnik Gene untersucht, die der regulatorischen Funktion dieser beiden Gengruppen unterliegen. Hierzu wurde in Kollaboration mit anderen Gruppen ein PCR-basierter DNA Microarray entwickelt, der ausgewählte Sequenzen für 20,948 ORFs enthält, die in einer neuen Annotation der Drosophila Genomsequenz identifiziert wurden. Um die in dieser Annotation enthaltenen 7,400 Gene zu validieren, die in vorangegangen Genvorhersagen nicht berücksichtigt wurden, wurde zunächst mit Hilfe des Microarrays ein Entwicklungsprofil mit neun verschiedenen Stadien des Lebenszyklus von Drosophila durchgeführt. Durch diese Analysen und molekularbiologische Validierungen über RT-PCR und in-situ Hybridisierungen konnten etwa 2,000 neue Gene für Drosophila bestätigt werden. Dieser Microarray wurde in weiteren Experimenten eingesetzt, um Hinweise auf Zielgene Polycomb-abhängiger Regulation zu bekommen. Dazu wurden Methoden entwickelt, um die Zielgene zu verschiedenen Zeitpunkten und in unterschiedlichen Geweben ermitteln zu können. Der Vergleich von cDNA Polycomb mutanter Fliegen mit Kontroll-cDNA auf dem Microarray gab erste Hinweise auf Zielgene in frühen embryonalen Stadien. Insgesamt legt diese Arbeit eine wichtige Grundlage für die Analyse aller Gene in Drosophila melanogaster, die über den Mechanismus des �zellulären Gedächtnisses� reguliert werden. Dieses Wissen wird dazu beitragen können, die komplexen Prozesse während der Entstehung eines Lebewesens besser zu verstehen.

Translation of abstract (English)

The immense efforts invested in the sequencing projects of the last years provided an enormous amount of digital information about the number and structure of the genes, as well as of the structural and functional organization of entire genomes. This information set the basis for experiments, which in future will permit the analyses of the function of each gene in the context of the Transcriptome. DNA microarrays are effective tools for these investigations. They allow the examination of the expression of mRNA pools in the context of the entire organism, at different time points of development or in various tissues. During this work, microarrays were used to study the mechanisms of epigenetic regulation. The Polycomb group and the trithorax group of genes accomplish elemental functions in this process termed �cellular memory�, and genes that are subject to this regulatory process were identified using microarrays. Therefore, a PCR-based DNA microarray was developed containing 20,948 ORFs that were identified in a new annotation of the Drosophila genomic sequence. In order to confirm the 7,400 genes that had not been predicted in genome annotations carried out by others, a developmental profiling approach was performed, which included nine different stages covering the complete life cycle of Drosophila. These analyses, together with RT-PCR and in-situ hybridisation experiments for validation, led to the identification of approximately 2,000 novel genes in the Drosophila genome. The novel DNA Microarray was subsequently used to identify genes that are subject to the regulation by the epigenetic machinery. Thus, different methods were developed to allow the identification of target genes of the Polycomb/trithorax groups at different time points of development. Comparing the cDNA of Pc-mutant flies with wild type cDNA on Microarrays led to the first indication of such target genes. Taken together this work provides the basis to further analyse all target genes of epigenetic mechanisms in a genome-wide context. This knowledge will eventually deepen the understanding of how the accurate development of an organism is attained.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Paro, Prof. Dr. Renato
Date of thesis defense: 8 December 2004
Date Deposited: 24 Jan 2005 14:03
Date: 2004
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Microarray, Drosophila
Uncontrolled Keywords: PolycombPolycomb
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