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Untersuchung des CRM1-abhängigen RNA-Exports mittels Repräsentativer Differenz-Analyse

Schütz, Sylvia

English Title: Investigation of the CRM1-dependent RNA-export by representational difference analysis

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PDF, German
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Abstract

Der Kern-/Cytoplasma-Transport von Proteinen und RNA-Protein-Komplexen durch die Kernpore wird von Transport-Rezeptoren der Importin beta-Familie vermittelt. Verschiedene Transport-Rezeptoren erkennen ihre Substrate anhand bestimmter Transportmotive. CRM1 ist ein Export-Rezeptor, der seine Substrate über Leucin-reiche Kern-Export-Signale bindet und daraufhin exportiert. Dieser Transport-Rezeptor hat ein weites Spektrum an Export-Substraten, da es sowohl Proteine als auch Protein-RNA-Komplexe wie ribosomale Untereinheiten, U snRNPs aber auch retrovirale ungespleißte mRNAs exportiert. Da es unwahrscheinlich erschien, daß CRM1 ausschließlich retrovirale mRNAs exportiert, bestand die Frage, ob CRM1 auch zelluläre mRNAs transportiert, auch wenn der konstitutive mRNA-Export durch den Export-Rezeptor TAP vermittelt wird. Zu diesem Thema gibt es nur vereinzelte Berichte über bestimmte mRNAs, die CRM1-vermittelt exportiert werden sollen. In dieser Arbeit wurde systematisch nach zellulären mRNAs gesucht, die mittels CRM1 exportiert werden. Dazu wurde der mRNA-Export in Zellen, die mit dem CRM1-spezifischen Inhibitor Leptomycin B (LMB) behandelt wurden, mit dem mRNA-Export von unbehandelten Zellen verglichen. CRM1-abhängig exportierte mRNAs sollten nach LMB-Behandlung im Kern akkumulieren und aus dem Cytoplasma depletiert werden. Zur Analyse des Kernexports der so behandelten Zellen wurde die Repräsentative Differenz-Analyse (RDA) eingesetzt. Die Validierung dieser Methode erfolgte mit Cl-4-Zellen, die einen Teil des Genoms des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) tragen und in denen CRM1-abhängiger Export der HIV-env-mRNA stattfindet. In diesen Zellen konnte der CRM1-vermittelte Export der env-mRNA gezeigt werden und dient deshalb als Positivkontrolle für das Funktionieren der RDA. Außerdem konnte gezeigt werden, daß Negativkontrollen wie die ß-actin- oder die GAPDH-mRNA nicht CRM1-abhängig exportiert werden. Neben der Durchführung der RDA mit Cl-4-Zellen wurde sie auch mit HeLa-Zellen durchgeführt. Mit der Analyse der Kern/Cytoplasma-Verteilung der aus den HeLa- und Cl-4-RDA erhaltenen RNAs konnte der CRM1-abhängige Export der 28S und 18S rRNA gezeigt werden. Zelluläre mRNA-Substrate von CRM1 konnten unter den gleichen Bedingungen jedoch nicht identifiziert werden. Daraus ergibt sich die Schlußfolgerung, daß der CRM1-vermittelte Export unter den gewählten Bedingungen kein bedeutender Exportweg für konstitutiv exprimierte zelluläre mRNAs in Cl-4- und HeLa-Zellen ist. Um den Kerntransport induzierbarer mRNAs zu untersuchen, wurde die T-Zell-Aktivierung als System ausgewählt. Nach Aktivierung der T-Zellen und Behandlung mit LMB konnten 11 verschiedene Transkripte wie z.B. die TNFalpha- oder die CD83-mRNA identifiziert werden, die eine veränderte Kern/Cytoplasma-Verteilung nach LMB-Behandlung zeigten. Mit Northernblot- und RT-PCR-Analysen konnte zusätzlich bewiesen werden, daß die Transkription der meisten untersuchten mRNAs durch T-Zell-Aktivierung induziert wird und daß Behandlung der Zellen mit LMB zur Reduktion der Gesamtmenge dieser mRNAs führt. Für sieben dieser mRNAs war außerdem die Bindung an das RNA-Binde-Protein HuR bereits gezeigt worden. HuR wird unter bestimmten Bedingungen durch CRM1 ins Cytoplasma transportiert, und deshalb könnte HuR als Adaptor im Export zwischen den identifizierten mRNAs und CRM1 fungieren. Die Identifizierung dieser induzierbaren CRM1-abhängigen mRNAs führt zu der Hypothese, daß der CRM1-abhängige Export ein Seitenweg für den mRNA-Export unter Aktivierungsbedingungen in T-Zellen ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kräusslich, Professor Hans-Georg
Date of thesis defense: 14 December 2004
Date Deposited: 11 Jan 2005 14:07
Date: 2004
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Hygiene-Institut
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: RNS, Zellkern, Messenger-RNS, Ribosomale RNS, Export, Hybridisierung <Biologie>
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