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Engineering Signal Transduction Pathways in Bacteria

Michalodimitrakis, Konstantinos

German Title: Untersuchung von gezielt veränderten Signalwegen in Bakterien

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Abstract

Veränderte Proteine sind ein wertvolles Handwerkzeug, sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Industrie. Ein nächster Schritt wäre Veränderungen in biologischen Stoffwechselwegen, z.B. in der Signalweiterleitung, vorzunehmen. Dieses könnte die Grundlage für viele Anwendungen sein, z.B. in der Gentherapie um neue Eigenschaften in Organismen einzuführen. Viele biologische Prozesse sind einem hohen Rauschpegel unterworfen, was für viele Anwendungen nicht geeignet ist. So können z.B in einer Population von Zellen die Gene unterschiedlich stark aktiviert werden, was zu niedriger oder hoher Expression führen kann. Daher ist es wichtig beim Entwurf von neuen Signalwegen, dass der Output gut kontrolliert werden kann. Da man solch einer Herausforderung nicht einfach gerecht werden kann, ist es besser mit einfachen und gut analysierten Signalwegen, wie sie z.B. in E.coli vorkommen, anzufangen. Die Signalweiterleitung in E.coli erfolgt hauptsächlich in Zwei-Komponenten Systemen. Diese bestehen aus einer Kinase als Sensor und einem Regulatorprotein, welches normalerweise ein Transkriptionsfaktor ist, mit einigen Ausnahmen, wie z.B CheY aus dem Chemotaxis Signalweg. In dieser Arbeit wurden zwei gut charakterisierte Signalwege durch einen chimärischen Sensor verbunden, um so einen neuen Signalweg herzustellen: Die Ligandenbindungsdomäne des Aspartat Receptors, Tar, aus dem chemotaxischen Signalweg wurde mit der katalytischen Domäne des osmosensorischen EnvZ kombiniert, um den chimärischen Rezeptor Taz herzustellen. Taz kann die Genexpresion aktivieren durch Phosphorylierung des Antwort-Regulators OmpR, über den Porin Promotor, nach Bindung eines geeigneten Liganden, wie z.B. Aspartat. Ziel dieser Studie war es dieses System zu nutzen um einen Signalweg herzustellen, dessen Output durch einen Gen-Schaltkreis kontrolliert ist, und das Eingangssignal durch gezieltes Design zu ändern. Als Output wurde ein etabliertes GFP verwendet und unterschiedliche Schaltkreise wurden verwendet: a) Kompetition von OmpR-P mit dem TetR Repressor, expremiert von einem synthetischen Promotor, zur Aktivierung des pompC Promotors, b) Expression von Antisense RNA für das Reportergen (GFP) and c) einen bistabilen Schalter durch TetR und einem temperatur-abhängigen Protein CI, welches durch OmpR-P aktiviert wird und die größte Regulation des Outputs ist. Trotz dieser unterschiedlichen Ansätze war es nicht möglich ein stabiles Konstrukt zu erhalten mit ausreichender Promotor Stärke, um einen Effekt aufzuweisen im Vergleich zu dem einfachen Reporter pompC-GPP. Das Liganden-Design erfolgte mit Hilfe der Algorithmen PERLA und FoldX sowie dem Programm SwissPdbViewer, basierend auf der Kristallstruktur der periplasmatischen Domäne von Tar im Komplex mit Glutamat. Obwohl diese Methode sehr vielversprechend aussah, als sie für einige Mutaten in dem Wildtyp Chemotaxis System durchgeführt wurde, war sie nicht erfolgreich um die Liganden des Chimären Rezeptors zu ändern. Ein Grund hierfür könnte sein, dass der chimäre Rezeptor in der periplasmatischen Domäne eine andere Konformation als der Wildtype Rezeptor hat, als Folge der Fusion mit der cytoplasmatischen Domäne von EnvZ. Dies wird durch experimenteller Ergebnisse unterstützt, die zeigen, dass Tar und Taz nicht dieselben Erkennungs-Eigenschaften haben, so z.B. können gleiche Signale für Tar entgegengesetzte Antworten durch Taz hervorrufen. Dennoch, in dieser Studie wurden in großem Detail die Eigenschaften von Taz untersucht, was zur ersten Entdeckung von Liganden (Aminosäuren) führte, die den Rezeptor inhibieren können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass diese Inhibierung stereo-spezifisch ist und extrem stark ist, sogar stärker als dieBindung von Liganden wie Aspartat. Weiterhin ergaben die intrinsischen Eigenschaften des Taz-OmpR Systems, die in dieser Studie gefunden wurden, eine neue Ansicht für das Wildtyp-System: Die Aktivierung des EnvZ-OmpR Systems in E. coli während des Zellwachstums scheint über EnvZ zu erfolgen, und die katalytische Domäne von EnvZ ist nicht ausreichend um dafür. Der wichtigste Befund aber für das chemotaxische System ist, dass einige der inhibitorischen Aminosäuren für Taz zu einer neuen, komplizierten Antwort führten und somit die Existenz eines bisher uncharakterisierten Adaptation Signalweges aufgedeckt wude.

Translation of abstract (English)

Engineered proteins have proven to be a very powerful tool both for basic research and industry. The next step in this direction is engineering biological pathways, such as signal transduction, which can set the foundations for a broad range of applications ranging from gene therapy to introducing novel properties in organisms. However a lot of biological processes are subjected to a lot of noise, which for most applications is not desired. For example, within a population of cells, different cells can express a gene at different levels ranging from zero to high expression. Therefore it is very important to design pathways whose output can be tightly controlled. Such a challenge is not easy to tackle, so before trying to addressing it in complex organisms, it is better to start from "simple" well-studied ones, like signal transduction in E.coli. Signal transduction in E.coli takes place mainly through two-component systems, consisting of a sensor-kinase and a response-regulator, which usually is a transcription factor, with few exceptions like CheY from the chemotaxis signalling pathway. In this study two of the best characterised signalling systems of E.coli are combined through a chimeric sensor, in order to construct a novel pathway: the ligand-binding domain of the aspartate receptor, Tar, from the chemotaxis pathway is combined with the catalytic domain of the osmosensor EnvZ resulting in the chimeric receptor Taz. Taz can activate gene expression from the porin promoters through phosphorylation of the response regulator OmpR, upon binding of a proper ligand, like aspartate. The aim of the study was to use this system as a template in order to construct a pathway whose output would be controlled by a gene circuit and to change the input signal through rational design. As an output a destabilised GFP was chosen and different circuitry were designed: competition of OmpR-P with TetR repressor, expressed from a synthetic promoter, for activation of the pompC promoter, expression of anti-sense RNA for the reporter gene (GFP) and finally a gene toggle switch, established by TetR and a temperature sensitive CI, which would be activated by OmpR-P and provide the tightest regulation of the output. Despite the different approaches used it was impossible to obtain stable constructs with sufficient promoter strength to have any effect compared to the simple reporter pompC-GFP. Rational design using Perla and Fold-X algorithms and SwissPdBViewer program was implemented on the crystal structure of the periplasmic domain of Tar in complex with aspartate. Although the power of this approach seemed very promising, when it was tested to predict the effect of mutations in the wild-type chemotaxis system, it was not successful in the case of changing the chimera�s ligand. This can be attributed to the fact that in the chimera the periplasmic moiety has a different conformation to the one in the wild-type receptor, caused by the fusion to the cytoplasmic domain of EnvZ. The latter is supported by experimental results showing that Tar and Taz do not have exactly the same sensing properties i.e. some signals of the same type for Tar can elicit opposite responses through Taz. However during the study it was necessary to re-examine in more detail the properties of Taz, leading for the first time to the discovery of ligands (amino acids) which can inhibit the receptor. This inhibition is proven to be stereo-specific and extremely tight, dominating even the effect of activators like aspartate. Furthermore, the intrinsic properties of the Taz-OmpR system found in this study gave a different perspective for the wild-type systems: activation of the EnvZ-OmpR system in E.coli during cell growth seems to take place through EnvZ and the catalytic domain of EnvZ is not sufficient to account fully for it. The most important finding was for the chemotaxis system where some of the inhibitory amino acids for Taz gave a novel complex response and revealed the existence of a yet uncharacterised adaptation pathway.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Clayton, Prof Christine
Date of thesis defense: 14 December 2004
Date Deposited: 24 Jan 2005 09:42
Date: 2004
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Chemotaxis, Methyl-akzeptierende Chemotaxis-Proteine, Signaltransduktion, Osmose, Bakterien
Uncontrolled Keywords: Chimaere , Protein-Ligand Wechselwirkungen , Gen-SchaltkreiseChimera , leucine , Taz , receptor , two-component
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