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Biochemische Analyse und Charakterisierung der White Collar Proteinkomplexe: Aufklärung des molekularen Mechanismus des negativen Feedbacks von FRQ auf den WCC in der circadianen Uhr von Neurospora crassa

Haase, Andrea

English Title: Biochemical Analysis and Charakterisation of the White Collar Protein Complexes: Identification of the molecular mechanism of negative feedback of FRQ to the WCC in the circadian clock of Neurospora crassa

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PDF, German
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Abstract

Fast alle Lebewesen haben ihren eigenen Lebensrhythmus an den täglichen Tag- Nacht- Rhythmus angepasst. Der Rhythmus wird gesteuert von der sogenannten inneren Uhr. Das sind molekulare Oszillatoren mit einer endogenen Periode von circa einem Tag. Daher der Name circadiane Uhr (lateinisch: „circa“ bedeutet ungefähr und „dies“ bedeutet Tag). Für das Verständnis der inneren Uhr ist es essentiell, die Interaktion der verschiedenen bekannten Uhrenproteine auf molekularem Niveau zu analysieren. Der Schleimpilz Neurospora crassa besitzt mindestens 3 Proteine, die für das Funktionieren der inneren Uhr notwendig sind. Das zentrale Uhrengen von Neurospora crassa heißt frequency (frq) und wird rhythmisch synthetisiert. Diese Rhythmik lässt sich sowohl auf RNA Ebene wie auch auf Proteinebene erkennen, wobei Protein-Peak und RNA-Peak jeweils 4-6 h phasenversetzt zu detektieren sind. Von grundlegender Bedeutung für das Funktionieren der inneren Uhr ist eine negative Rückkopplungsschleife, die durch das Uhrenprotein FRQ ausgeführt wird. Die Expression von FRQ führt zunächst zu einer Assemblierung von FRQ in einem hochmolekularen Komplex unbekannter Stöchiometrie und Zusammensetzung, der dann phosphoryliert und auf einem bisher nicht genauer untersuchten Weg in den Kern transportiert wird. Dort bewirkt der FRQ- Komplex eine Abschaltung seiner eigenen Biosynthese (transkriptionelle Regulation) wie auch das Abschalten verschiedener "Output"- Gene (ebenfalls auf transkriptioneller Ebene). Der genaue Mechanismus dieser Abschaltung ist unbekannt. Dieser ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit und läuft wahrscheinlich zum großen Teil durch eine von FRQ induzierte Phosphorylierung des White Collar Proteinkomplexes (WCC). Dabei kommt es zu einer direkten Interaktion von FRQ mit dem WCC, der von den beiden anderen essentiellen Uhrenproteinen White- Collar 1 und White- Collar 2 gebildet wird. Bei diesen beiden Proteinen handelt es sich um Transkriptionsfaktoren, die über eine PAS- Domäne miteinander interagieren können und über einen GATA-Typ Zn-Finger die Transkription sowohl von frq als auch von anderen für das Output wichtigen Genen aktivieren. Ich habe mich mit der molekularen Analyse der verschiedenen Komplexe beschäftigt, d.h. mit der Anzahl, dem stöchiometrischen Aufbau und der Regulierung. Die zentralen Fragen sind, wie viele verschiedene Komplexe existieren und wie ihre genaue Stöchiometrie ist, wo diese Komplexe zu welchem circadianen Zeitpunkt lokalisiert sind und was ihre genaue Funktion in dem jeweiligen Kompartiment ist. Außerdem stellt sich die Frage, ob diese Funktion durch weitere Ereignisse wie z.B. Phosporylierung weiter reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit gelang es mir, die Natur des negativen Feedback des FRQ Proteins auf den WCC auf eine FRQ abhängige Phosphorylierung des WCC zurückzuführen. Ich habe die Natur dieser Phosphorylierung eingehend untersucht und charakterisiert. Gleichzeitig habe ich die Phosphorylierungsstellen eingegrenzt und entsprechende Punktmutanten hergestellt und ebenfalls untersucht. Darüber hinaus gelang es mir WC-2 als TAP-Tag zu klonieren und nativ aus Neurospora aufzureinigen. Außerdem habe ich versucht, über verschiedene Ansätze neue, potentielle Interaktionspartner und deren Funktion zu identifizieren.

Translation of abstract (English)

Nearly all organisms have adapted their own life rhythm to the daily day- night- rhythm. The rhythm is regulated by the so called inner clock. These are molecular oscillators with an endogenous period of approximately one day. Therefore they are called circadian clocks (latin “circa” meaning approximately and “dies” meaning a day). For the understanding of the endogenous clock it is essential to study the interaction of the different known clock proteins on a molecular level. The fungus Neurospora crassa has at least 3 proteins which are essential for the endogenous clock. The central clock gene is called frequency (frq) and is synthesized rhythmically. The rhythm is detectable on RNA and on protein level, with RNA and protein peak being seperated by a 4- 6 h phase delay. Of fundamental meaning for the circadian clock is the negative feedback of FRQ. After the expression of FRQ, FRQ is assembled into a high molecular weight complex of unknown stochiometry, which is then phosphorylated and transported into the nucleus. There FRQ shuts off its own synthesis (transcriptional regulation) and shuts off the synthesis of the output genes (also transcriptional regulation). The exact mechanism of the shut off is not known. This was the subject of the following thesis. It probably is a FRQ induced phosphorylation of the White Collar protein complex (WCC). Thereby FRQ directly interacts with the WCC, which is composed of the other two essential clock proteins White Collar 1 and White Collar 2. These are transcription factors that interact via a PAS domain and regulate the expression of frequency and of output genes via a GATA typ Zn finger. I have worked on the molecular analysis of the different complexes meaning the number, the stochiometric structure and the regulation of the different complexes. The central questions are how many different complexes exist, what is the exact stochiometry of them, where are they located at the different circadian timepoints and what is the exact function of them in the specific compartement. Besides this there is the question whether their function is regulated in addition by for instance a phosphorylation. In this work I have revealed the nature of the negative feedback of FRQ. It is a FRQ dependent phosphorylation of the WCC. I have studied the nature of this phosphorylation in detail and I have determined the putative phosphorylation sites and generated point mutants. I have cloned a TAP tagged version of WC-2 and purified WC-2 via the TAP tag out of Neurospora. Besides this I have searched with various methods for new putative interaction partners of WC-2.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Brunner, Prof Michael
Date of thesis defense: 16 February 2005
Date Deposited: 21 Feb 2005 14:06
Date: 2005
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Neurospora, negatives Feedback, WCC
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