Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Identifizierung und Charakterisierung einer tumorentitätspezifisch überexprimierten Protein-Isoform eines bisher unbekannten Gens

Wasser, Birgit

[img]
Preview
PDF, German
Download (1358Kb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Die Progression von benignen Neoplasien zu malignen Tumoren wird von spezifischen Veränderungen des Genexpressionsmusters begleitet. Die Analyse der differentiellen Genexpression kann daher der Aufklärung der molekularen Mechanismen in der Pathogenese eines Tumors dienen. Zudem können tumorspezifisch überexprimierte Gene in der Krebsdiagnostik eine Anwendung als molekulare Marker finden, indem sie karzinogene Zellen nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei alternative Methoden, die Hybridisierung von Protein-Arrays und die in-silico-Analyse von EST-Datenbanken, eingesetzt, mit denen es möglich war potentiell tumorassoziierte Kandidaten-Gene zu identifizieren. Sechs der gefundenen Kandidaten-Gene konnten durch die Anwendung der Real-Time-PCR-Technik als differentiell regulierte Gene im Kolon- oder Lungenkarzinom nachgewiesen werden. Bis auf ein identifiziertes überexprimiertes Gen (GRPR), sind für die Gene bisher weder eine Funktion noch eine differentielle Expression detektiert worden. Aufgrund der signifikanten Überexpression in Lungen-Adenokarzinomen wurde das unbekannte Gen EST 5364 für eine nähere Charakterisierung ausgewählt und mit LUMA (Lung Marker) benannt. Die vorliegende Arbeit charakterisiert das Gen LUMA auf molekularbiologischer und die Genprodukte auf Protein-Ebene. Die vollständige Länge des LUMA-Transkriptes konnte durch eine „full-length“-Klonierung isoliert werden und korrelierte mit der in einer Northern Blot Analyse detektierten Transkript-Größe. Anhand von Sequenzierungen konnte eine komplexe Vielfalt von alternativen LUMA-Spleiß-Varianten identifiziert werden, die zu drei verschiedenen Carboxy-terminalen Protein-Isoformen führen. Zu LUMA orthologe, bisher unbekannte Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen wurden in verschiedenen Organismen identifiziert und weisen auf eine evolutionäre Konservierung und funktionelle Bedeutung des bisher unbekannten Gens hin. Da keine paralogen Gene ermittelt werden konnten, bestehen derzeit keine Hinweise auf die Zugehörigkeit von LUMA zu einer humanen Genfamilie. Eine computerbasierende Analyse der LUMA-Protein-Isoformen ergab, dass es sich wahrscheinlich um lösliche Proteine handelt, die zudem Coiled-Coil-Strukturen aufweisen. Die hydrophobe Aminosäureverteilung im C-Terminus einer Spleiß-Variante (LUMA-16A), die durch alternatives Spleißen generiert wird, könnte eine potentielle Transmembran-Domäne darstellen. Mit generierten polyklonalen und monoklonalen Antikörpern konnte nachgewiesen werden, dass das transkribierte Gen auch translatiert wird und, dass das LUMA-Protein im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine detaillierte RNA-Expressionsstudie an verschiedenen Normalgeweben, Tumor-Zelllinien und Paaren von Lungen Tumor- und Normalgeweben, konnte belegen, dass bestimmte Spleißvarianten sich in ihren Expressionsmustern unterscheiden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass zwei Spleiß-Varianten (LUMA-15A, LUMA-15B), die sich durch Sequenzunterschiede im Exon 15 auszeichnen, tumorspezifisch überexprimiert werden. Eine weitere Spleiß-Variante des Exons 15 (LUMA-D15) zeigte hingegen ein ubiquitäres Expressionmuster in benignen und karzinogenen Zellen. Die Resultate deuten darauf hin, dass die alternative Prozessierung des Exons 15, von dem drei verschiedenen Formen detektiert wurden, eine zentrale Rolle bei der tumorspezifischen Genexpression von LUMA spielt. In immunhistochemischen Analysen an Lungengeweben konnten die auf RNA-Ebene detektierten Expressionsprofile der Spleiß-Varianten auch für die entsprechenden Protein-Isoformen auf Protein-Ebene bestätigt werden. Durch umfassende immunhistochemische Analysen an Lungengeweben wurde nachgewiesen, dass die Protein-Isoform LUMA-15A in sämtlichen analysierten Lungenkarzinom-Subtypen, von NSCL über SCLC, sowie in Lungemetastasen anderer Tumorentitäten meist stark exprimiert wird. Demgegenüber zeigten Lungen-Normalgewebe und Gewebeproben von nicht karzinogenen Lungenerkrankungen keine oder geringe LUMA-15A-Expressionen. Die Auswertung dieser Ergebnisse in Hinsicht auf einen potentiellen LUMA-Diagnostik-Marker zeigte, dass Werte von 90,9% für die Sensitivität und 95,3% für die Spezifität erreicht wurden. In immunhistochemischen Analysen konnte zudem eine erhöhte Expression von LUMA-15A in Blasenkarzinomen im Vergleich zu Blasen-Normalgeweben nachgewiesen werden. Eine LUMA-15-Expression wurde auch auf zytologischer-Ebene in Zellen aus Bronchialsekreten detektiert. Durch eine Doppelfärbung von LUMA-15A und Ki67 war es in Bronchialsekreten von Lungenkarzinom-Patienten (Plattenepithel- und Adenokarzinom) möglich, maligne Zellen spezifisch zu identifizieren. Eine Expression von LUMA-15A als auch von Ki67 wurde lediglich in Tumorzellen nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine potentielle pathogenetische Bedeutung von LUMA-Spleiß-Varianten bzw. Protein-Isoformen im Bronchial- und Blasenkarzinom hin und bieten möglicherweise die Basis für die Entwicklung eines Krebs-Diagnostik-Tests.

Translation of abstract (English)

Despite increasing knowledge of genomic aberrations and modified genes in colorectal and bronchial carcinoma, the pathogenetic mechanism of these two diseases is not sufficiently understood. The progression of benign neoplasia to malign tumours is attended by specific changes in gene expression patterns. Therefore the analysis of differential gene expression can be used to detect molecular pathogenetic mechanisms in tumourigenesis. In addition, tumour-specific overexpressed genes can find application as molecular markers in cancer diagnostics detecting malign cells. In the present work two alternative methods were used to identify potentially tumour-associated candidate-genes: hybridisation of protein-arrays and in-silico-analysis of EST-databases. Six of the identified candidate-genes were shown to be differentially regulated genes using quantitative Real-Time-PCR-technology. Except one gene (GRPR), neither function nor differential expression was identified for the six analysed candidate-genes so far. Due to significant overexpression in lung-adenocarcinomas, the unknown gene EST 5364 was selected for further analysis and named LUMA (Lung Marker). The present work is characterising the molecular aspects of the gene LUMA and its gene products. The complete LUMA transcript was isolated by full-length-cloning and correlated with the detected size of a transcript from a Northern Blot analysis. A complex variety of alternatively spliced forms of human LUMA was identified by sequence analysis resulting in three different carboxy-terminal protein isoforms. Unknown orthologous LUMA nucleotide and amino acid sequences were detectable in several organisms. This indicates the conservation and functional importance of the previously unknown gene. As no paralogous LUMA gene was detectable, there is no information for the membership of LUMA to a human gene family. Computerbased analysis of LUMA protein isoforms predicted soluble proteins and calculated coiled-coil motifs. A hydrophobic amino acid distribution in the C-terminus of one spliced form (LUMA-16A), which is generated by alternative splicing, represents a potential transmembrane domain. By generating polyclonal and monoclonal antibodies it was shown that the transcribed gene is also translated into a protein and that the LUMA protein is localized in cytoplasm. A detailed RNA-expression study of different normal tissues, tumour cell lines and pairs of lung tumour and normal tissues identified different expression patterns for various alternatively spliced transcripts. It was shown that two types of alternatively spliced forms (LUMA-15A, LUMA-15B), characterized by differences in the exon 15 sequence, have tumour-specific expression patterns. Another alternatively spliced transcript of exon 15 (LUMA-D15) was found to have an ubiquitous expression in benign and malign cells. These results suggest that the alternative splicing of exon 15, which was detected in three different forms, plays a central role in the tumour-specific gene expression of LUMA. In immunohistochemical analyses of lung tissues the expression profiles of the alternatively spliced forms, which were detected on RNA-level, were confirmed by the corresponding protein-isoforms on protein-level. Detailed immunohistochemistry analyses of lung tissues demonstrated a mostly strong expression of LUMA-15A in all subtypes of lung carcinomas, including NSCL and SCLC, as well as in lung metastases of other tumour entities. On the other hand, in lung normal tissues and tissues of non cancerous lung diseases none or low LUMA-15A-expression was detected. Regarding these results in relation to a potential LUMA-diagnostic-marker, values of 90,9 % for sensitivity and 95,3 % for specificity were revealed. In addition, increased expression of LUMA-15A in bladder carcinomas compared to normal bladder tissues was shown in immunohistochemical analyses. LUMA-15A-expression was also detected on cytological-level in cells of bronchial secretion. Using double-staining of Ki67 and LUMA-15A a specific identification of malign cells in bronchial secretions of lung cancer patients (squamous cell carcinoma and adenocarcinoma) was revealed. The expression of LUMA-15A as well as of Ki67 was only demonstrated in tumour cells. The results of the present work indicate a potential pathogenetic relevance of alternatively spliced LUMA forms and protein isoforms in bronchial and bladder carcinoma and provide a possible basis for the development of a cancer-diagnostic-test.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dübel, Prof Stefan
Date of thesis defense: 16. July 2004
Date Deposited: 22. Feb 2005 07:54
Date: 2004
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Pathologisches Institut
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Tumormarker, Kleinzelliges Bronchialkarzinom, Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom
Uncontrolled Keywords: Blasenkarzinom
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative