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PNA-Ligand Bioconjugates as Potential Building Blocks for Sequence-Specific, Metal-Mediated DNA-/RNA-Cleavage

Kersebohm, Tim

German Title: PNA-Ligand-Biokonjugate als Potentielle Bausteine für die Sequenzspezifische, Metallvermittelte DNA-/RNA-Spaltung

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Abstract

In this Thesis, the development of new nuclease mimics on the basis of PNA-metal bioconjugates is described. The design of artificial enzymes for sequence-specific DNA and RNA cleavage is one of the most challenging problems in modern biotechnology, since the commercially available biotools are restricted to a limited number of promoter sequences. Possible nuclease mimics consist of a recognition- and a cleavage domain, with the latter one in this case being chosen to be a metal complex. Complexes of several chelating nitrogen ligands are proved to catalyze the phosphodiester cleavage of oligonucleotides. In the course of this Thesis, functionalized nitrogen ligands (terpyridine, bis-picolylamine and phenanthroline) were synthesized, and their metal binding behaviour in unsubstituted form and as pseudoneurotensin conjugates were investigated, revealing different binding modes depending on the type of ligand and its substitution. As a recognition domain, PNA (peptide nucleic acid), a DNA mimic with a pseudopeptide backbone was chosen, and the synthesis of monomer building blocks was optimized. PNA oligomers with terminal ligand substitution were developed, and their DNA hybridization behaviour was examined by UV melting experiments, revealing the intercalating effect of a terminal terpyridine ligand. A new criterion for the significance of PNA DNA melting curves was introduced. The influence of the replacement of one internal PNA monomer with two unsubstituted amino acids on hybridization is described. Presumably, a bulge structure is formed by the modified PNA, involving the insight that the substituted PNA nucleotide does not have to be omitted for optimum attraction. A new and versatile method for the internal derivatization of PNA oligomers was developed by the introduction of a p-nitro-phenylalanine residue which is reduced on resin and is accessible for peptide bond formation. A large variety of ligands, organometallic moieties or fluorescent markers can thus be coupled to PNA oligomers at any position.

Translation of abstract (German)

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Entwicklung neuer künstlicher Nucleasen, basierend auf PNA-Metall-Biokonjugaten beschrieben. Das Design künstlicher Enzyme für die sequenzspezifische DNA- und RNA-Spaltung ist eine der größten Herausforderungen der modernen Biotechnologie, da die kommerziell erhältlichen Werkzeuge auf einige wenige Promotersequenzen beschränkt sind. Mögliche Nucleasen bestehen aus einer Erkennungs- und einem Spaltungsdomäne, wobei die Letztere in diesem Fall ein Metallkomplex sein sollte. Komplexe vieler verschiedener stickstoffhaltiger Chelatliganden sind in der Lage, die Spaltung von Phosphodiesterbindungen in Oligonucleotiden zu katalysieren. In dieser Arbeit wurden funktionalisierte Stickstoffliganden (Terpyridin, Bis-Picolylamin and Phenanthrolin) synthetisiert, und ihr Metallbindungsverhalten in unsubstituiertem Zustand und in Form von Pseudoneurotensin-Konjugaten wurde untersucht. Die Wahl einer Erkennungsdomäne fiel auf PNA (Peptide Nucleic Acid), einem DNA-Analogon mit einem Pseudopeptid-Rückgrat, und die Synthese der Monomerbausteine wurde optimiert. PNA-Oligomere mit endständiger Ligandsubstitution wurden entwickelt, und ihr Hybridisierungsverhalten mit komplementärer DNA wurde mittels UV-Schmelzexperimenten untersucht. Hierbei zeigte sich ein interkalierender Effekt des endständigen Terpyridin-Liganden. Ein neues Kriterium für die Signifikanz von PNA DNA-Schmelzkurven wurde eingeführt. Der Einfluß einer internen Substitution eines PNA-Monomers durch ein Dipeptid auf die Hybridisierung wurde beschrieben und führte zu dem Ergebnis, daß die modifizierte PNA aller Wahrscheinlichkeit nach eine Schleifenstruktur ausbildet, so daß für eine optimale attraktive Wechselwirkung kein PNA-Monomer ersetzt, sondern das Dipeptid eingeschoben werden sollte. Desweiteren wurde eine interne Derivatisierung von PNA-Oligomeren durch den Einbau eines p-Nitro-Phenylalanin-Bausteins erreicht, der am Harz reduziert wird und dadurch für eine Peptidbindung zur Verfügung steht. Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, eine vielfältige Anzahl von Liganden, Organometallverbingungen oder Fluoreszenzmarkern an jeder beliebigen Stelle des PNA-Oligomers einzuführen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Metzler-Nolte, Prof. Dr. Nils
Date of thesis defense: 23 February 2005
Date Deposited: 09 Mar 2005 13:20
Date: 2005
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Peptid-Nucleinsäuren (PNA), Antisense-Oligonucleotide, Oligonucleotide, Nucleasen, Spaltung, Kupfer, Neurotensin
Uncontrolled Keywords: Terpyridin , Bis-Picolylamin , Phenanthrolin , Schmelzkurven , Hybridisierung , Peptide , künstliche RestriktionsenzymePeptide Nucleic Acids (PNA) , antisense oligonucleotides , artificial nucleases , neurotensin , melting curves
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