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Topology of Genes in Mammalian Cell Nuclei with Special Emphasis on the MLL Gene and Its Translocation Partners

Murmann, Andrea Eveline

German Title: Räumliche Struktur von Genen im Säugetierzellkern mit Schwerpunkt auf MLL und seinen Translokationspartnern

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Abstract

Chromosomal translocations are the cause of many forms of leukemia. The mechanisms of how they occur are poorly understood. After a double strand break event, chromosomes are fused generating derivative chromosomes. During the fusion, a chimeric gene can be created and a fusion protein with new functions may be expressed which might cause malignant transformation. One such gene is MLL, which can be fused to a large number of other genes in different types of leukemias. It is believed that the 3D localization of genes, involved in chromosomal translocations in the interphase nucleus of certain hematopoietic tissues, could be a determining factor for a translocation event. This work has analyzed the 3D localization of MLL and some of its major translocation partners in the interphase nucleus of various cells cultured under different conditions, as well as in cell lines carrying translocation involving these genes. An analysis procedure was developed to precisely determine gene positions in the 3D space of the spherical interphase nucleus of hematopoietic cells. The nuclear localization of a gene relative to the nuclear center and the nuclear periphery was determined. To provide a general understanding of the distribution pattern of a given locus within the nucleus, the nuclear volume was divided into five concentric shells in two different ways: 1. shells, of same thickness, which permitted detection of large differences in the position of genes, and 2. shells, whose volume were identical, which permitted a high resolution for genes that were close to the nuclear periphery. Using these tools, the positions of MLL, five of its translocation partners, (AF4, AF6, AF9, ENL and ELL) and four control loci (2q33, 2q35, 7q22 and 8q34) were analyzed in different human cell lines of hematopoietic origin and in primary hematopoietic stem cells. Despite the cell materials’ differences in maturation state, cell lineage, and chromosome number, the localization of each gene and chromosomal locus showed a characteristic distribution pattern in the interphase nucleus in all studied hematopoietic cells, with the extremes being 2q35 having the most peripheral position, and the genes ENL and ELL on 19p13 sharing the most interior nuclear position. The three most common translocation partners of MLL (AF4, AF6 and AF9) were found to be remarkably similar in their localization, which was more peripheral than that of MLL. The position of MLL and AF9 relative to the nuclear surface was independent of the cell cycle and the induction of DSB/apoptosis. Interestingly, despite the differences in distances to the nuclear surface that were characteristic, distance analyses and angle measurements among genes revealed, that their relative positioning to each other is random. The effect of translocations on gene position was also studied in various cell lines carrying well defined translocations involving MLL and its translocation partners AF4, AF6 or AF9. For this study, a designed set of locus specific probes allowed the simultaneous detection of the genes on the normal and the derivative chromosomes. The positions for the normal genes were notably different from the positions of the fusion genes depending on the type of translocation. The analysis of gene density of whole chromosomes and local gene density, within a 2 Mbp window surrounding the locus, revealed a strong correlation between the nuclear position of a locus and its local gene density. In general, genes in areas of high local gene density were found towards the nuclear center, whereas genes in regions of low gene density were detected near the nuclear periphery. The gene density within a 2 Mbp window was determined to be a good predictor for the relative positioning of a locus within the nucleus and could explain the change of position observed after translocation events. Furthermore a correlation between the position of a locus and its position relative to its chromosomal territory seemed to be linked to the gene density. The "2 Mbp prediction" was successfully applied to various examples of nuclear positional studies published in the literature. This work revealed therefore new insight into the nuclear architecture of mammalian cells and has identified principles that determine the 3D position of genes in the nucleus. The results of this work that could help us to better understand the basis for chromosomal translocations that cause leukemia.

Translation of abstract (German)

Viele Formen von Leukämie sind durch chromosomale Translokationen charakterisiert. Die Mechanismen, die zu Translokationen führen sind wenig verstanden. Der Fusion von Chromosomen gehen Doppelstrangbrüche voraus. Dies führt häufig zur Bildung von derivaten Chromosomen und der Expression von chimären Genen und Genprodukten mit neuen Funktionen, welche zelluläre Transformation verursachen können. Eines der Gene, die häufig an Translokationen beteiligt sind, ist MLL, welches in verschiedenen Leukämiearten mit einer Reihe von anderen Genen fusionieren kann. Man nimmt an, dass die Position von Genen im Interphasezellkern bestimmter hämatopoietischer Gewebe eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Translokationen spielen kann. In dieser Arbeit wurde die Lage von MLL und einiger seiner wichtigsten Translokationspartner im 3 dimensionalen Raum des Interphasezellkerns in verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungen untersucht, sowie die Lage dieser Gene auf derivaten Chromosomen. Zuerst wurde eine Analysemethode entwickelt, mit deren Hilfe die akkurate Position von Genen im 3D Volumen des sphärischen Interphasenukleus hämatopoietischer Zellen ermittelt werden kann. Um einen generellen Überblick über das Verteilungsmuster eines Gens innerhalb des Zellkerns zu gewinnen, wurde der nukleare Raum in 5 konzentrische Schalen auf zweierlei Art unterteilt: 1. In Schalen gleicher Dicke, und 2. in Schalen gleichen Volumens. Der Einsatz dieser Methoden erlaubte zum einen die Darstellung großer Positionsunterschiede genomischer Loci im Nukleus und zum anderen eine hohe Auflösung von Genen nahe der nuklearen Oberfläche. Mit Hilfe dieser Methoden wurden die Positionen von MLL, fünf seiner Translokationspartner (AF4, AF6, AF9, ENL und ELL) und 4 Kontroll-Loci (2q33, 2q35, 7q22 und 8q34) in verschiedenen menschlichen Zellinien hämatopoietischen Ursprungs sowie primären hämatopoietischen Stammzellen bestimmt. Die Position der analysierten Loci erschien generell unabhängig vom Reifungsgrad, von der Differenzierung oder von der Anzahl der Chromosomen der analysierten Zellen zu sein. Alle Loci zeigten ein charakteristisches Verteilungsmuster im Interphasekern aller untersuchten Zellen. 2q35 nahm eine extrem randständige Position ein, wohingegen die Gene ENL und ELL auf 19p13 die zentralste Position einnahmen. Die drei häufigsten Translokationspartner von MLL (AF4, AF6 und AF9) zeigten eine auffällige Ähnlichkeit in ihrer 3D Position, die randständiger war als die von MLL. Die Lage von MLL und AF9 relativ zur Kernoberfläche war unabhängig von Zellzyklus und Induktion von Doppelstrangbrüchen/Apoptose. Obwohl die Abstände der Gene zur nukleären Oberfläche für jedes Gen charakteristisch waren, zeigte die Analyse von Abständen und Winkeln der Gene zueinander eine zufällige Verteilung. Schließlich wurde der Effekt chromosomaler Translokationen auf die Genposition in verschiedenen Zellinien untersucht, die gut charakterisierte Translokationen aufwiesen, an denen MLL und jeweils einer der Translokationspartner AF4, AF6 oder AF9 beteiligt waren. Dafür wurden Gen-spezifische Proben hergestellt, mit denen gleichzeitig die Gene auf normalen und derivaten Chromosomen gefärbt werden konnten. Die Positionen der Gene auf normalen und derivaten Chromosomen war deutlich unterschiedlich und abhängig davon, welche Translokation vorlag. Der Vergleich der Gendichte ganzer Chromosomen mit der eines Bereiches von 2 Mbp um einen Gen-Locus herum zeigte eine starke Korrelation zwischen der nuklearen Position des Locus und der lokalen Gendichte. Generell wurden Loci mit hoher Gendichte im Kerninneren gefunden, Loci mit niedriger Gendichte hingegen in der Kernperipherie. Die Bestimmung der Gendichte im 2 Mbp Fenster erlaubte eine gute Vorhersage der Veränderung der Position eines Locus nach einer Translokation. Dies konnte auch erfolgreich für verschiedene veröffentlichte Befunde zur nuklearen Positionierung von Genen demonstriert werden. Die vorliegende Arbeit liefert neue Einblicke in die nukleare Architektur von Säugetierzellen und hat Prinzipien aufgedeckt, die die 3D Position eines Gens im Nukleus bestimmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit könnten helfen, die Mechanismen, die der Entstehung chromosomaler Translokationen zu Grunde liegen und zu Leukämie führen, besser zu verstehen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Buselmaier, Prof. Dr. Werner
Date of thesis defense: 21. December 2004
Date Deposited: 30. Mar 2005 07:57
Date: 2004
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Interphase, Translokation
Uncontrolled Keywords: LeukämieInterphase , leukemia , nuclear architecture , translocation
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