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Die Rolle des C-Terminus von Env in der HIV-1-Infektion und -Replikation

Holtkotte, Denise

English Title: The Role of the C-terminus of Env in HIV-1 infection and replication

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PDF, German
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Abstract

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, Einsichten in die Rolle des ungewöhnlich langen C-Terminus von HIV-1-Env (Env-CT) in der Infektion und Replikation zu gewinnen. Es ist bisher nicht bekannt, aus welchen Gründen die Länge des Env-CTs in vivo streng konserviert ist und Virusmutanten mit trunkierten Env-CTs in vitro einen Replikationsblock in nicht-permissiven Zellen aufweisen. Der für die Mutante pNL-Tr712 schon gezeigte Zelltyp-abhängige Defekt hinsichtlich der Replikationskompetenz wurde in nicht-permissiven H9-Zellen bestätigt und auf weitere HIV-1-Derivate mit Trunkationen in Env-CT und Mutationen in Env-TMD ausgedehnt. Bezüglich der Permissivität einiger weniger Zellinien, z.B. MT-4-Zellen, für Virusmutanten mit trunkierten Env-CTs wurde gezeigt, daß ein permissiver Phänotyp wahrscheinlich nicht auf deren HTLV-1-Tax-Expression beruht und auch nicht durch Expression des Env-CTs in trans in nicht-permissiven H9-Zellen induziert werden kann. Im Fall der Mutante pNL-Tr752 konnte ein einziger Aminosäureaustausch den durch die Trunkation des Env-CTs induzierten Zelltyp-spezifischen Replikationsblock kompensieren: pNL-Tr752(N750K) war in der Lage, trotz trunkiertem Env-CT in nicht-permissiven H9-Zellen und PBMCs zu replizieren. Dies bedeutet, daß möglicherweise nicht ausschließlich die Länge des Env-CTs, sondern auch dessen Funktionalität und Konformation für eine erfolgreiche HIV-1-Ausbreitung in gewissen Zellsystemen von Bedeutung sind. Einbau- und Funktionalitäts-Analysen der mutierten Glykoproteine sowie single round of infection-Analysen zeigten schließlich, daß aus H9-Zellen freigesetzte zellfreie pNL-Tr752-Virionen nicht prinzipiell per se defekt waren. Im Vergleich zu pNL-Wt- oder pNL-Tr752(N750K)-Virionen besaßen zellfreie pNL-Tr752-Virionen aus H9- und MT-4-Zellen eine nur geringfügig reduzierte Infektiosität von 30-50%. Eine wichtige und zentrale Beobachtung war hierbei, daß H9-Zellen im Gegensatz zu MT-4-Zellen generell nur äußerst schlecht von allen zellfreien Virionen, inklusive pNL-Wt-Virionen, infizierbar waren. Da Virusreplikation in Zellen die Summe aus Zell-Zell-Transmission und Infektionsvorgängen durch zellfreie Virionen darstellt, deutet die letzte Beobachtung darauf hin, daß Virusausbreitung in H9-Zellen hauptsächlich durch Zell-Zell-Transmission stattfindet. Es ist somit möglich, daß Virusmutanten mit trunkierten Env-Proteinen deswegen nicht in H9-Zellen replizieren können, da sie einen Defekt bei der Zell-Zell-Transmission aufweisen, der auf dem Fehlen des Env-CTs beruht. Der Env-CT könnte für die Zell-Zell-Transmission von HIV-1 essentielle Funktionen wie etwa die Reorganisation des Zytoskeletts übernehmen, eine Vermutung, die sich darauf stützt, daß identifizierte Bindungspartner des Env-CTs mit dem Zytoskelett assoziiert sind. Die hier postulierte und bisher nicht beschriebene potentielle Rolle des Env-CTs bei der Zell-Zell-Transmission von HIV-1 liefert somit eine wichtige Basis für zukünftige Studien in diese Richtung.

Translation of abstract (English)

The aim of this study was to gain insight into the role of the unusually long C-terminus of HIV-1-Env (Env-CT) in infection and replication. Until now, it has remained unclear why the length of the Env-CT is highly conserved in vivo and why mutant virions encoding for truncated Env-CTs exhibit a replication block in non-permissive cells in vitro. The cell-type dependent replication defect, which had already been demonstrated for the mutant pNL-Tr712, was confirmed in non-permissive cells and was expanded to further HIV-1-derivatives carrying truncations in Env-CT and mutations in Env-TMD. With regard to the permissivity of some few cell lines, e.g. MT-4-cells, for the replication of mutant virions encoding for truncated Env-CTs, it was established that the permissive phenotype is most probably not based on their HTLV-1-Tax expression. Furthermore, it was shown that expression of the Env-CT in trans could not overcome the non-permissive phenotype of H9-cells. In the case of the mutant pNL-Tr752 encoding for a truncated Env-CT, it was demonstrated that a single amino acid exchange could compensate for the cell-type dependent replication block: the variant pNL-Tr752(N750K) was able to replicate in non-permissive H9-cells and in PBMCs despite its truncated Env-CT. This means that functional and conformational determinants rather than exclusively the overall length of the Env-CT probably influence the ability of HIV-1 to spread in certain cell systems. An important finding, based on analyses of mutant Env functionality and incorporation into virions, as well as on single round of infection assays, was that pNL-Tr752-virions were actually only moderately defective per se. Thus it was reproducibly demonstrated that cell-free pNL-Tr752-virions, whether produced in non-permissive H9-cells or in permissive MT-4-cells, exhibited only a slightly reduced infectivity of about 30-50% in comparison to pNL-Wt or pNL-Tr752(N750K). A further central finding was that, in contrast to MT-4-cells, H9-cells were only poorly infectible with any of the employed cell-free virions, including pNL-Wt-virions. Since virus replication in cell culture is the sum of cell-free and cell-cell virus transmission, this latter observation points to virus spread in H9-cells occurring predominantly via cell-cell transmission. Thus it is hypothesised that mutant virions encoding for truncated Env-Proteins cannot replicate in these cells since they exhibit a defect in cell-cell transmission due to the lack of the Env-CT. The presence of the Env-CT could potentially be required to mediate the rearrangements of cytoskeletal structures which have been shown to be essential for the process of cell-cell transmission. This proposal is supported by the fact that two of the identified binding partners of the Env-CT are cytoskeleton-associated proteins. A potential role of the HIV-1-Env-CT in cell-cell transmission has not been described so far. Therefore the present study represents an important basis for future studies in this direction.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bosch, Prof. Dr. Valerie,
Date of thesis defense: 13 January 2005
Date Deposited: 12 Apr 2005 14:13
Date: 2004
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: HIV, Glykoproteine, HIV-Infektion
Uncontrolled Keywords: Env-Glykoprotein , HIV-Replikation , Zell-Zell-Transmission , trunkiertes Glykoprotein , zytoplasmatische DomäneEnv glycoprotein , HIV Replication , cell-cell transmission , truncated glycoprotein , cytoplasmic tail
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