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Post-translational Insertion of a Small Tail-Anchored Protein into the Membrane of the Endoplasmic Reticulum

Spasic, Milan

German Title: Posttranslationale Insertion eines Kurzem "tail"-verankerten Proteins in die Membran des Endoplasmatisches Retikulums

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Abstract

Proteins destined for membrane insertion can be targeted to and inserted into the endoplasmic reticulum (ER) either during synthesis (cotranslationally) or after their synthesis is completed (post-translationally). While the cotranslational pathway is well characterized, much less is known about a post-translational pathway for targeting and insertion of membrane proteins. In this study post-translational targeting and insertion of the small, tail-anchored ER membrane protein RAMP4op was analyzed. RAMP4op has been chosen as a model because of its small overall length, carboxy terminal location of the transmembrane (TM) domain and the presence of the short cytoplasmic segment. This allows investigation to be focused on the significance of the TM domain in processes of ER targeting and insertion. Membrane targeting and insertion of RAMP4op was analyzed in the rabbit reticulocytes lysate in vitro translation system supplemented with rough microsomal membranes (RM) post-translationally. Upon insertion into the membrane, RAMP4op becomes N-glycosylated. This allows clear discrimination between cytosolic and membrane inserted forms of the protein. In this assay system, RAMP4op can be efficiently targeted and inserted into RM using a post-translational pathway dependent on ATP hydrolysis. In the absence of membranes and after release from the ribosome, RAMP4op was detected in a defined soluble cytosolic complex. Cytosolic RAMP4op could be maintained in an insertionally competent state for at least one hour. Chemical crosslinking was used to search for and analyze potential interacting partners of RAMP4op. In the absence of membranes, a single cytosolic, non-ribosomal protein of 40 kDa (p40) was discovered in the proximity of RAMP4op. The interaction with p40 is established via the TM domain of RAMP4op. This interaction is hydrophobic in nature since cross-linking between RAMP4op and p40 is abolished in the presence of a non-ionic detergent. In the presence of RM RAMP4op could not be cross-linked to p40. Cross-linking between these two proteins was re-established upon removal of membranes. This suggests that the interaction between RAMP4op and p40 is part of the pathway for post-translational targeting of RAMP4op. Treatment of RM with trypsin resulted in significantly reduced efficiency of RAMP4op insertion. This shows that ER membrane proteins are required for the efficient post-translational insertion of RAMP4op. Treatment of RM with trypsin in lower concentrations, sufficient to inactivate SRP receptor, had no effect on the efficiency of RAMP4op post-translational insertion. Therefore, functional SRP receptor is not required for the ER insertion of RAMP4op. In context of these findings, cytosolic factors that are possible candidates for p40 or may be involved in an ATP hydrolysis-dependent step during RAMP4op post-translational targeting/insertion are discussed.

Translation of abstract (German)

Integrale Membranproteine können entweder gleichzeitig mit ihrer Synthese, d. h. cotranslational, oder nach Abschluss ihre Synthese, d. h. posttranslational, in die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) inseriert werden. Während der cotranslationale Insertionsprozess vergleichsweise gut charakterisiert wurde, ist nur wenig über die Vorgänge bei der posttranslationalen Membraninsertion bekannt. In dieser Arbeit wurde die posttranslationale Membraninsertion des kleinen ER-Proteins RAMP4op untersucht, welches über seinen Carboxyterminus in die Membran inseriert wird. Dieses so genannte „tail-anchored“ RAMP4op wurde als Modellsubstrat ausgewählt, da es eine relativ kurze Aminosäuresequenz besitzt und außer seiner carboxyterminalen Transmembrandomäne (TMD) nur ein kleines cytoplasmatisches Segment besitzt. Diese Besonderheiten erlaubten die Fokussierung auf die Funktion der TMD bei der ER-Membraninsertion. Die Lokalisierung und Insertion von RAMP4op in die Membran wurde in einem in vitro Retikulozyten-Lysat Translationssystem untersucht, dem posttranslational ribosomenbesetzte mikrosomale Membranen (RM) zugesetzt werden konnten. Die Membraninsertion von RAMP4op führt zur N-Glykosylierung des Proteins, die eine Unterscheidung von cytosolischen und membraninserierten Formen erlaubt. In dem verwendeten System kann RAMP4op effizient auf einem ATP-abhängigen, posttranslationalen Weg in die RM inserieren. In der Abwesenheit von Membranen und nach der Freisetzung vom Ribosom konnte RAMP4op in einem löslichen, cytosolischen Komplex identifiziert werden. Dieses cytosolische RAMP4op befand sich in einem stabilen, insertionskompetenten Zustand. Mittels chemischer Quervernetzung wurde nach möglichen Interaktionspartnern von RAMP4op gesucht. In der Abwesenheit von Membranen konnte ein cytosolisches, nicht-ribosomales Protein mit einem Molekulargewicht von 40 kDa (p40) als Interaktionspartner identifiziert werden. Die Wechselwirkung von p40 mit RAMP4op wird über seine TMD vermittelt. Es handelt sich um eine hydrophobe Interaktion, da sie durch Zugabe von nicht-ionischen Detergenzien unterbunden werden konnte. In der Anwesenheit von RM erfolgte keine Quervernetzung von RAMP4op und p40; wurden jedoch die Membranen anschließend wieder entfernt, so konnte erneut eine Interaktion beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Interaktion von RAMP4op und p40 Bestandteil des posttranslationalen Insertionswegs für RAMP4op ist. Die Trypsinbehandlung von RM reduzierte die Membraninsertion von RAMP4op signifikant. Proteine der ER-Membran sind also für eine effiziente posttranslationale Insertion erforderlich. Niedrige Trypsinkonzentrationen, die für die Inaktivierung des SRP-Rezeptors hinreichend sind, besitzen jedoch keinen Effekt auf die posttranslationale Insertion. Ein funktioneller SRP-Rezeptor ist also für die ER-Insertion von RAMP4op nicht erforderlich. In diesem Zusammenhang werden cytosolische Faktoren diskutiert, die als mögliche Kandidaten für p40 in Frage kommen oder die an einem ATP-abhängigen Schritt bei der posttranslationalen Insertion von RAMP4op beteiligt sind.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dobberstein, Prof. Dr. Bernhard
Date of thesis defense: 4 May 2005
Date Deposited: 24 May 2005 15:31
Date: 2005
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Endoplasmatisches Retikulum, Membrantransport, Membranproteine, Translokation
Uncontrolled Keywords: posttranslational insertion , tail-anchored proteins
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