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Regulation of P-glycoprotein at the Blood-Brain Barrier

Hartz, Anika Maria Sophie

German Title: Regulation von P-glycoprotein in der Blut-Hirn-Schranke

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Abstract

Over 1 billion people worldwide suffer from some type of central nervous system (CNS) disorder (WHO, The World Health Report, 2001). This includes depression, epilepsy, multiple sclerosis, brain tumors, Alzheimer’s and Parkinson’s disease, as well as infections of the brain such as meningitis and HIV encephalitis. Consequently, there is a strong demand for effective treatments. However, pharmacotherapy of CNS disorders is greatly impaired by poor blood-to-brain transport of a large number of therapeutic drugs. The structure responsible for the low CNS penetration of drugs is the blood-brain barrier. An important element of barrier function is the ATP-driven efflux transporter, P-glycoprotein (P-gp) that denies CNS entry to a myriad of therapeutics. Thus, a better understanding of the mechanisms regulating P-gp expression and transport function might provide new strategies to improve drug delivery to the brain and increase drug levels in the CNS. Therefore, the objective of this thesis was to study regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier. P-glycoprotein transport function was assessed by measuring accumulation of the fluorescent, P-gp-specific substrate, NBD-cyclosporine A (NBD-CSA), in the lumens of isolated rat brain capillaries using confocal microscopy and quantitative image analysis. Exposing capillaries to the hormone endothelin-1 (ET-1) rapidly and reversibly reduced luminal NBD-CSA accumulation. Importantly, ET-1 did not affect tight junctions. Sarafotoxin, an ET-B receptor agonist, also reduced P-gp-mediated transport; the effects of ET-1 and sarafotoxin were blocked by an ET-B receptor antagonist, but not by an ET-A receptor antagonist. Immunostaining localized the ET-B receptor to the luminal and abluminal membranes of brain capillaries. NBD-CSA transport was also reduced by the NO donor, sodium nitroprusside (SNP), and by the protein kinase C (PKC) activator, PMA. Inhibition of NO synthase (NOS) or PKC blocked the effect of ET-1; PKC inhibition blocked the effects of SNP and PMA. Thus, P-glycoprotein function at the blood-brain barrier is regulated in the short-term by ET-1 acting through an ET-B receptor, NOS, NO and PKC (Hartz et al., 2004). Transcriptional regulation of P-glycoprotein by the ligand-activated transcription factor, pregnane X receptor (PXR), was also demonstrated. PXR was shown for the first time to be expressed in isolated rat brain capillaries by RT-PCR, Western blot analysis and immunostaining. Six-hour exposure of isolated capillaries to the PXR ligands, PCN or dexamethasone, significantly increased expression of P-gp in the plasma membrane. Consistent with this, P-gp immunostaining demonstrated significantly increased immunoreactivity at the luminal membrane of capillaries. Increased P-gp-mediated NBD-CSA transport into capillary lumens was also detected. No such increases in P-gp expression were found when capillaries were exposed to ligands that activate human PXR (hyperforin, paclitaxel), but do not activate rodent PXR. Importantly, an increase in P-glycoprotein expression and transport function was also found in capillaries isolated from rats injected with PCN and dexamethasone (Bauer et al., 2004).

Translation of abstract (German)

Mehr als 1 Milliarde Menschen weltweit leidet an Erkrankungen des Zentralnerven-systems (ZNS) (WHO, The World Health Report, 2001). Hierzu zählen Depressionen, Epilepsie, Multiple Sklerose, Gehirntumore, Alzheimer-Demenz, Parkinson-Syndrom, sowie Infektionen des Gehirns (Hirnhautentzündung, HIV Enzephalopathie). Die medikamentöse Therapie von ZNS-Erkrankungen ist wegen der schlechten Hirngängigkeit vieler Arzneistoffe jedoch stark eingeschränkt. Verantwortlich für dieses Problem ist das Endothel der Kapillaren im Gehirn, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke. Einen wesentlichen Anteil an der Schrankenfunktion hat der Efflux-Transporter P-glycoprotein (P-gp), der einerseits das Gehirn vor Toxinen schützt, andererseits aber auch zahlreiche Arzneistoffe daran hindert, in das ZNS zu gelangen. Ein Forschungsansatz um die Hirngängigkeit von Pharmaka zu erhöhen und somit die Therapie von ZNS-Erkrankungen zu verbesseren besteht darin, die Regulation von P-glycoprotein aufzuklären. Daher steht im Mittelpunkt dieser Arbeit die Regulation der P-glycoprotein Expression und Transportfunktion in der Blut-Hirn-Schranke. Zunächst wurde die Kurzzeitregulation der P-glycoprotein Transportfunktion untersucht. Hierzu wurden isolierte Gehirnkapillaren der Ratte mit dem fluoreszierenden P-gp-Substrat NBD-Cyclosporin A (NBD-CSA) inkubiert. Die Anreicherung der NBD-CSA Fluoreszenz im Kapillarlumen wurde mittels konfokaler Lasermikroskopie und quantitativer Bildanalyse ermittelt. Inkubation der Kapillaren mit dem Hormon Endothelin-1 (ET-1) verringerte die luminale NBD-CSA-Fluoreszenz innerhalb von Minuten; dieser Effekt war reversibel wenn ET-1 entfernt wurde. Die Abnahme der luminalen NBD-CSA Fluoreszenz wurde ausschlieβlich durch einen Effekt auf P-gp hervorgerufen, da ET-1 keinen Einfluss auf die Tight Junctions hatte. Neben ET-1 verringerte auch Sarafotoxin, ein ET-B-Rezeptor-Agonist, den P-gp-vermittelten NBD-CSA-Transport. Sowohl der Effekt von ET-1 als auch der von Sarafotoxin wurden durch einen ET-B-Rezeptor-Antagonisten aufgehoben, nicht aber durch einen ET-A-Rezeptor-Antagonisten. Die Expression des ET-B-Rezeptors wurde durch Immunfärbung in der luminalen und abluminalen Kapillarmembran nachgewiesen. Der NBD-CSA Transport wurde auch durch Natriumnitroprussid (NNP), einem NO-Donor, sowie durch PMA, einem Aktivator der Proteinkinase C (PKC), verringert. Durch Inhibition der NO Synthase oder der PKC wurde der Effekt von ET-1 vollständig aufgehoben. Inhibition der PKC hemmte die Effekte von NNP und PMA. Diese Ergebnisse zeigen, dass die P-glycoprotein Transportfunktion in der Blut-Hirn-Schranke durch ET-1 reguliert wird. Die durch ET-1 vermittelte Kurzzeitregulation von P-gp verläuft über den ET-B-Rezeptor, NOS, NO und PKC (Hartz et al., 2004). Im zweiten Teil der Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation von P-glycoprotein durch den Nuklearrezeptor PXR (Pregnane X Rezeptor) untersucht. Zum ersten Mal konnte mit Hilfe von RT-PCR, Western Blot und Immunfärbung gezeigt werden, dass PXR in isolierten Gehirnkapillaren von Ratten exprimiert ist. Inkubation isolierter Kapillaren mit den PXR Liganden PCN oder Dexamethason über einen Zeitraum von 6 Stunden erhöhte die Expression von P-gp in der luminalen Kapillarmembran signifikant. Dies wurde über quantitative Immunfärbung und Western Blots gezeigt; auch der NBD-CSA-Transport durch P-gp war erhöht. Wurden die Kapillaren mit Liganden (Hyperforin, Paclitaxel) inkubiert, die nur den humanen PXR aktivieren nicht aber den von Ratten, so war P-gp nicht verstärkt exprimiert. Auch in vivo Versuche mit Ratten, denen PCN und Dexamethason injiziert wurde, ergaben, dass die P-gp Expression und Transportfunktion in Gehirnkapillaren stark erhöht war. P-gp war ausserdem auch in Leber und Niere induziert (Bauer et al., 2004).

Item Type: Dissertation
Supervisor: Fricker, Professor Gert
Date of thesis defense: 24 June 2005
Date Deposited: 29 Jun 2005 08:10
Date: 2005
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Blut-Hirn-Schranke, ABC-Transporter, Endothelin, Genregulation
Uncontrolled Keywords: P-glycoprotein , PXR , Nuklear-RezeptorBlood-Brain Barrier , P-glycoprotein , Nuclear Receptor , Endothelin-1
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