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Abstract

Diese Arbeit wurde durchgeführt, um Gene, die axonale Wegfindung im Nervensystem von Caenorhabditis elegans steuern, zu identifizieren. C. elegans stellt aufgrund seiner einzigartigen physiologischen Eigenschaften ein gutes Modellsystem für das Studium einer Vielzahl biologischer Prozesse dar. Das Nervensystem von C. elegans ist einfach strukturiert und umfasst 302 Neuronen. Diese Neuronen bilden stereotype Netzwerke mit ihren anterior-posterior und dorsal-ventral verlaufenden axonalen Fortsätzen aus. In dieser Arbeit nutzen wir die kürzlich beschriebene Methode der RNA Interferenz (RNAi) im Wurm zur Identifikation von neuen Genen der axonalen Wegfindung. Allerdings ist das Nervensystem von C. elegans resistent gegen systemische RNAi und Transport von doppelsträngigen RNA Molekülen in benachbarte nicht-neuronale Zellen veranlasst keine neuronale RNAi. Aus diesem Grund begannen wir mit der Identifizierung von C. elegans Mutanten, die eine erhöhte Empfindlichkeit für RNAi im Nervensystem aufweisen. Eine chemische Mutagenese wurde durchgeführt, gefolgt von einem Screen nach Mutanten mit effizienter RNAi im Nervensystem. Eine der Mutanten (nre-1, für neuronal RNAi efficient) zeigte starke Suppression der Genexpression im Nervensystem nach RNAi durch Füttern. Wir nutzten die nre-1 supersensitive Mutante für einen revers genetischen Screen zur Idenfizierung von Genen der axonalen Wegfindung in C. elegans. Um die Fortsätze der Nervenzellen sichtbar zu machen, wurde ein transgener Stamm im nre-1 Hintergrund erzeugt, in dem ein Teil der Inter- und Motoneurone durch gelb fluoreszierendes Protein (YFP) markiert ist. Dieser Stamm wurde für einen Screen von 2416 Genen auf Chromosom I verwendet. Dazu wurde eine library von Bakterienklonen, die einem bestimmten Gen entsprechende dsRNA exprimieren, an C. elegans verfüttert. Der Screen führte zur Identifizierung von 57 Kandidatengenen, die penetrante axonale Wegfindungsdefekte in Motoneuron-Kommissuren und Axonen des Ventralstrangs in C. elegans zur Folge haben. Die identifizierten Gene sind involviert in eine Vielzahl von biologischen Prozessen wie DNA-Metabolismus, Translation, Transkription und Signaltransduktion. Einige kodieren für Zelloberflächenmoleküle und Zytoskelettkomponenten. Zusätzlich zu neuen Genen konnten im Screen Gene identifiziert werden, die in andere biologische Prozesse involviert sind, aber bis jetzt nicht mit axonaler Wegfindung in Verbindung gebracht wurden. Beispielsweise führt Verlust von pry-1, einem Axin Homolog in C. elegans, zu axonalen Defekten. Axin ist ein assoziierter Faktor des ß-Catenin Komplexes und damit ein negativer Regulator in Wnt vermittelter Signaltransduktion. Weitere Studien an anderen, in diesem Screen identifizierten Kandidatengenen wie z.B. neuen Rezeptoren, Signalmolekülen, Kinasen und Transkriptionsfaktoren können uns in Zukunft einen weiteren Einblick in die molekularen Mechanismen der axonalen Wegfindung geben.

Translation of abstract (English)

This study was undertaken to identify genes involved in axon guidance in the nervous system of Caenorabditis elegans. Due to its unique physiological properties, the nematode worm C. elegans is a powerful genetic model system to study a variety of biological processes. The nervous system of C. elegans is a simple organ comprising 302 neurons. These neurons create stereotypic neuronal networks formed by their anterior-posterior and dorsal-ventral running axons. Here, we took advantage of the recently discovered phenomenon of RNA interference in the worm to identify axon guidance genes. However, the nervous system of C. elegans is refractory to the systemic RNA interference, and delivery of dsRNA molecules to the neighboring non-neuronal cells does not initiate RNAi in the neurons of the worm. Therefore, we started with the identification of mutants of C. elegans that are efficient for RNAi in the nervous system. A standard chemical mutagenesis screen was performed to identify mutants of the worm that showed enhanced RNAi efficiency in the nervous system. One of the mutants (nre-1, for neuronal RNAi efficient) showed marked suppression of gene expression in the nervous system by feeding RNAi approach. We used the nre-1 supersensitive strain as a tool in a reverse genetic screen to identify genes required for axon guidance in C. elegans. A transgenic strain was constructed in the nre-1 background, wherein a subset of interneurons and motor neurons were labeled with the yellow fluorescent protein to visualize axons of the neurons. We used this strain to screen 2416 gene of the worm located on chromosome I by feeding a library of bacterial clones expressing dsRNA fragments specific to the genes. This screen has identified 57 candidate genes that give rise to penetrant axon guidance defects in the commissural and ventral nerve cord axons in C. elegans. The genes identified include genes involved in various cellular processes such as DNA metabolism, translation, transcription, cell-surface molecules, signaling pathways and cytoskeletal molecules. In addition to novel genes, the screen has also identified genes that have been previously implicated in other cell biological processes, but their roles in axon guidance were not known. For example, this screen has identified a C. elegans axin homolog pry-1, a signaling molecule involved in a Wnt signaling pathway. Axin is an associated factor of the ?-catenin complex and is a negative regulator of Wnt signals. Besides, further studies on other candidate genes, e.g. novel receptors, signaling molecules, kinases and transcription factors identified in this screen should provide us with more information on the molecular mechanisms employed by neurons to steer their axo