English Title: Introduction of recombinant Newcastle Disease Virus as vector for therapeutic genes in tumor therapy

Preview

PDF, German Download (4MB) | Terms of use

Abstract

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Modifikation einer erfolgreichen Methode zur Erzeugung von Anti-Tumor-Immunantworten bei Krebspatienten. Diese sogenannte aktiv spezifische Immuntherapie (ASI) bedient sich der Vakzinierung mit lebenden, inaktivierten und durch Newcastle Disease Virus (NDV) infizierten patienteneigenen Tumorzellen. Die antitumoralen Effekte der etablierten NDV Ulster (NDV) basierten Tumorvakzine sollten in dieser Arbeit durch den Einsatz rekombinanter NDV Viren vom Stamm LaSota (NDFL(+)) und durch Integration therapeutischer Gene in deren Genom verbessert werden. Zwei neue virale Vektoren standen für diese Aufgabe zur Verfügung: NDFL(IL-2) trägt das Gen für humanes Interleukin-2 (IL-2), einem Wachstumsfaktor für T-Lymphozyten, und NDFL(GM-CSF) das Gen für humanen granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), der Einfluss auf antigen-präsentierende Zellen (APZ), wie z.B. Dendritische Zellen (DZ) hat. Es konnte gezeigt werden, dass Infektion mit NDFL(IL-2) oder NDFL(GM-CSF) in verschiedenen Tumorzellen zur Expression von biologisch aktivem IL-2 bzw. GM-CSF führt. Die Genexpression korrelierte mit der gemessenen Replikation der Viren in den einzelnen Zelllinien. Die verwendeten rekombinanten LaSota-Viren zeigten im Vergleich zu NDV Ulster eine gesteigerte Fähigkeit Immunzellen gegen den Tumor zu aktivieren. Es konnte ferner nachgewiesen werden, dass die rekombinanten Varianten NDFL(IL-2) und NDFL(GM-CSF) in einem neu etablierten in vitro Tumor-Neutralisations-Assay (TNA) stärkere antitumorale Wirkungen entfalten als ihr Wildtyp NDFL(+). Diese verbesserte antitumorale Wirkung war nachweislich nicht auf Veränderungen von Eigenschaften im Bereich Bindung, Replikation, Tumorselektivität oder Reinfektion zurückzuführen. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass die LaSota-Viren im Vergleich zu NDV Ulster stärker Apoptose in den Vakzinezellen induzieren, was zu einer verstärkten Produktion von Onkolysaten und damit zu einer verbesserten Antigenpräsentation durch APZs führt. Verantwortlich dafür scheinen Gefahrensignale zu sein, die von virusinfizierten Onkolysaten ausgehen. Die Expression von GM-CSF durch NDFL(GM-CSF) führt zu einer zusätzlichen Verbesserung der ko-stimulatorischen Kapazitäten von DZ sowie zu ihrer Rekrutierung und Reifung. Außerdem führte der Kontakt mit NDV zu einer starken Expression von IFN-alpha; durch aufgereinigte, Toll Like Receptor (TLR) positive plasmazytoide Dendritische Zellen (PDZ). Es konnte weiter gezeigt werden, dass NDFL(+) infizierte Vakzinezellen zur besseren Aktivierung von CD14+ Monozyten und im Vergleich zu NDV Ulster, zu einer stärkeren Expression von TNF related apoptosis inducing ligand (TRAIL) führen, was teilweise die Begründung für die gesteigerte antitumoralen Wirkung von NDFL(+) darstellen könnte. NDFL(+) infizierte Vakzinezellen führen bei aufgereinigten NK-Zellen zur Aktivierung, die im Fall einer NDFL(IL-2)- oder NDFL(GM-CSF)-Infektion weiter gesteigert werden kann. Außerdem sind nur NDFL(IL-2) infizierte Vakzinezellen in der Lage CD8+ T-Zellen zu aktivieren und zu Exozytose-Aktivität sowie zur Sekretion von IFN-gamma; anzuregen. Dieses IFN-gamma; scheint mit der gesteigerten TRAIL-Expression durch NDFL(IL-2) infizierte Vakzinezellen auf CD14+ Monozyten in Zusammenhang zu stehen. In einem autologen in vitro Assay, bestehend aus primären Tumorzellen und T-Zellen von zugehörigen Tumor-drainierenden Lymphknoten von HNO-Tumor-Patienten, waren nur die NDFL(IL-2) infizierten autologen Tumorzellen in der Lage vorhandene Memory-T-Zellen zur Produktion von IFN-gamma; anregen. Die Verwendung von autologen Tumorzellen scheint dabei für die Aktivierung im ELISpot-Assay unbedingt erforderlich zu sein. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass rekombinantes NDV als Vektor für die Einführung potentieller therapeutischer Gene in eine Lebendzell-Vakzine als sehr nützlich angesehen werden kann.

Translation of abstract (English)

The presented thesis deals with modifications and extensions of a promising method called active specific immunotherapy (ASI). This method generates anti-tumor responses in tumor patients, by using a vacciantion strategy employing autologous virusinfected viable but inactivated tumor cells. The aim of this study was to test whether anti-tumor effects could be further augmented by using recombinant NDV strain LaSota (NDFL(+)) instead of wildtype NDV strain Ulster as a vector for additional potential therapeutic genes. Two new viral vectors were available for this purpose: The first, NDFL(IL-2), had incorporated the gene coding for human Interleukin-2 (IL-2), a T lymphocyte growth factor, the second, NDFL(GM-CSF), contained the gene for human granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF), which could exert additional effects on antigen presenting cells (APCs) such as Dendritic cells (DCs). It could be shown that infection of different types of tumor cells by NDFL(IL-2) or NDFL(GM-CSF) results in the expression of biologically active and stable IL-2 or GM-CSF, respectively. Gene expression correlated with the competence of the respective viruses to replicate in the particular tumor cells. In an in vitro tumor neutralisation assay (TNA), it could be shown, that immune cells are better activated to exert anti-tumor activity by a tumor vaccine prepared with NDFL(+) than by a vaccine prepared with NDV Ulster. Superior anti-tumor effects could be demonstrated for the recombinat variants NDFL(IL-2) and NDFL(GM-CSF) in comparison to NDFL(+). This improved anti-tumor effect of the LaSota wildtype and its recombinant variants was not due to changes in virus binding, replication, selectivity or reinfection capacities. It could rather be shown that LaSota viruses induce more apoptosis in the infected tumor cells than NDV Ulster resulting in a more efficient production of oncolysates available for processing by APCs. Danger signals which arise during generation of oncolysates by the virus seem to be responsible for APC activation. In addition, expression of GM-CSF by NDFL(GM-CSF) infected vaccine cells supported an increase in the co-stimulatory capacities of DCs as well as their recruitment and maturation. Furthermore, it could be shown that NDV leads to a strong induction of IFN-alpha; by stimulating toll like receptor (TLR) expressing purified plasmacytoid dendritic cells and to activation of monocytes. NDFL(+) infected vaccine cells caused a better activation of CD14+ monocytes and led to a stronger expression of tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand (TRAIL) than NDV Ulster. Involvement of TRAIL in the anti-tumor effect of the viruses shown in the TNA could be demonstrated. The increase of TRAIL expression by NDFL(+) seems to be partly responsible for the accelerated anti-tumor effect of NDFL(+) in comparison to NDV Ulster. Contact of NDFL(+) infected vaccine cells with purified human NK cells also caused their activation, which could be further increased by NDFL(IL-2) or NDFL(GM-CSF) infection. Concerning effects on purified human T cells only NDFL(IL-2) infected tumor cells were able to induce accellerated exocytotic activity, CD69 and IFN-gamma; expression by CD8+ T cells. The IFN-gamma; response seemed to contribute to the further increased TRAIL expression of CD14+ monocytes stimulated by NDFL(IL-2) infected vaccine cells in comparison to NDFL(+) infected vaccine cells. In an autologous in vitro system, which includes tumor vaccine cells and T cells from tumor draining lymph nodes of HNO tumor patients, only NDFL(IL-2) infected vaccine cells were able to activate preexisting immune memory cells and to stimulate them to secrete IFN-gamma;. The use of autologous tumor cells appeared to be prerequisite for such ELISpot responses. In conclusion, it could be shown that recombinant NDV can be a very useful vector for the introduction of therapeutic genes into a tumor vaccine.