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Synthese modifizierter Peptidnukleinsäuren und deren Anwendung zur DNA-Analyse

Boll, Iris

English Title: Synthesis of modified peptide nucleic acids and their application for DNA analysis

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PDF, German
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Abstract

Im Verlauf dieser Arbeit wurden Metallkomplex-funktionalisierte Peptidnukleinsäuren und intern modifizierte Peptidnukleinsäuren synthetisiert und deren Anwendung zur sequenzspezifischen DNA-Analyse untersucht. Ligationsreaktionen modifizierter Oligonukleotide (und deren Analoga) am Nukleinsäure-Templat finden Anwendung zur Detektion von DNA. Die Produkte dieser Reaktionen binden dabei deutlich stärker an das DNA-Templat als die Edukte. Daher sind diese Umsetzungen meist stöchiometrisch. Katalytische, Templat-gesteuerte Reaktionen wären für die Analyse wesentlich interessanter, da dann ein DNA-Molekül zur Umsetzung einer Reihe von Edukten führen könnte. Durch diesen Effekt wäre die Analyse geringer Mengen von DNA möglich. In dieser Arbeit wurde die katalytische Hydrolyse einer Ester-PNA durch ein Cu2+-Komplex-PNA-Konjugat untersucht, die sowohl durch Einzelstrang-DNA als auch durch Doppelstrang-DNA gesteuert werden kann. Die Hydrolyse einer Ester-PNA am Einzelstrang-DNA-Templat, die durch den Kupferkomplex einer Katalysator-PNA katalysiert wird, erreicht eine > 100-fache kinetische Diskriminierung zwischen DNAs, die sich nur an einer einzigen Nukleotid-Position unterscheiden. Auf Basis dieser Reaktion konnte eine vollständig homogene, empfindliche Methode zur sequenzspezifischen Detektion von Einzelstrang-DNA (10 fmol DNA) entwickelt werden. In einem einzelnen Experiment ist mit dieser Methode die Erkennung einer von vier DNAs, die sich nur in einer einzelnen Position unterscheiden, möglich. In Gegenwart eines Doppelstrang-DNA-Templates, welches zu der Ester-PNA und der PNA LCu komplementär ist, ist die anfängliche Spaltgeschwindigkeit 7-mal höher als in Abwesenheit eines Templates. Durch „mismatch“-Doppelstrang-Template, die entweder auf der Seite, an der die Ester-PNA bindet, oder auf der Seite, an der die PNA-LCu bindet, Fehlbasenpaarungen enthalten, wird die Ester-Hydrolyse im Vergleich zur Hintergrund-Hydrolyse (ohne Templat) nicht wesentlich beschleunigt. Da das Cu2+-Ion vermutlich fest an ein Assoziat gebunden ist, das aus der Substrat-PNA, der Katalysator-PNA und dem Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-DNA-Templat besteht, kann diese Analysenmethode auch bei Systemen mit Puffern, die Cu2+-bindende Liganden enthalten, angewendet werden, wie z. B. PCR-Puffer und physiologischer Puffer. Zur DNA-Analyse können auch Reaktionen komplementärer Peptidnukleinsäuren verwendet werden, die durch Hybridisierung nicht beschleunigt, sondern inhibiert werden. In dieser Arbeit wurde die Spaltung einer intern Disulfid-modifizierten PNA untersucht. Als Spaltreagenzien wurden verschiedene Phosphine und Thiole getestet. Die beste Selektivität konnte mit Tris-(carboxyethyl)-phosphin erreicht werden. Dieses Phosphin spaltet die Einzelstrang-Disulfid-PNA 33-mal schneller als die Disulfid-PNA in der PNA / DNA-Duplex.

Translation of abstract (English)

Within this study metal complex functionalized peptide nucleic acids und internally modified peptide nucleic acids were synthesized and their reactions on DNA templates have been investigated. Ligations of oligonucleotides (and their analogues) on nucleic acid templates are used in detection of DNA. Products of these reactions are considerably stronger binders of DNA templates than the educts are. Therefore these reactions are usually stoichiometric. Catalytic templated reactions are much more interesting for analysis, because one DNA molecule can trigger transformation of several educts. This amplification effect can allow analysis of low amounts of DNA. In this study a reaction of catalytic ester-PNA hydrolysis by Cu(II) complex-PNA conjugates, which is triggered by single-stranded DNA as well as double-stranded DNA as templates, has been investigated. The hydrolysis of an ester-PNA on a single-stranded DNA template catalysed by a copper complex of a catalyst-PNA provides > 100 fold kinetic discrimination between DNAs, which are different from each other only at a single nucleotide position. On the basis of this reaction a fully homogeneous and sensitive assay for sequence specific detection of single stranded DNA has been developed (10 fmol DNA). Identification of one of four DNAs (variation at one position) can be done in a single experiment. In the presence of a double-stranded DNA template, which is complementary to ester-PNA and PNA-LCu, the initial cleavage of ester-PNA is 7 times faster than in the absence of any template. Double-stranded templates with mismatches at binding sites of either ester-PNA or PNA-LCu do not significantly accelerate hydrolysis of ester-PNA relative to its background hydrolysis. Since Cu2+ ion is tightly bound in an associate containing the ester-PNA, the metal complex- PNA and the template DNA (single-stranded or double-stranded), application of this method in buffers containing other Cu2+ binding ligands, e.g. PCR buffer and physiological buffer, is possible. Reactions of nucleic acids, which are inhibited rather than triggered by their complementary strands, can be also used in analysis. In this study cleavage of an internally disulfide-modified PNA was investigated. A couple of phosphines and thiols were tested as cleaving reagents. Tris-(carboxyethyl)-phosphine is the mostly selective cleaver of single-stranded disulfide-PNA substrates among tested reducing agents. It cleaves single-stranded disulfide-PNA 33 times faster than disulfide-PNA in the PNA / DNA-duplex.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Krämer, Prof. Dr. Roland
Date of thesis defense: 8. July 2005
Date Deposited: 15. Aug 2005 15:15
Date: 2005
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Peptid-Nucleinsäuren, HPLC, Matrix-unterstützte Laser-Desorption
Uncontrolled Keywords: Esterspaltung , DNA-Templat , Disulfidspaltung
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