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Phospholipase A 2 in der Parvovirus MVMp induzierten Zelllyse

Peters, Julia

English Title: Phospholipase A 2 in parvovirus MVMp induced cell lysis

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PDF, German
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Abstract

Das autonome Parvovirus Minute Virus of Mice MVMp ist ein onkolytisches Virus, da es selektiv neoplastisch transformierte Zellen infiziert und tötet. Während viele zytotoxische Effekte, die eine MVMp Infektion hervorruft, auf Aktivitäten des viralen NS1 Proteins zurückgeführt wurden, sind die Ursachen der MVMp induzierten Wirtszelllyse und ihr Mechanismus bisher unklar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, virale und zelluläre Faktoren der MVMp induzierten Zelllyse zu identifizieren. Es wurde vermutet, dass Phospholipase A2 (PLA2) Enzyme, die in sekretorische sPLA2, zytosolische cPLA2 und Ca2+-unabhängige iPLA2 unterteilt werden, aus den folgenden Gründen für diesen Zusammenhang von Bedeutung sein könnten. Zum einen sind sie als Phospholipidhydrolasen, neben der Produktion von Lipidsignalmediatoren, auch als wichtige Effektoren schwerwiegender Membranveränderungen in der Zelle bekannt. Zum anderen verfügt das parvovirale Kapsidprotein VP1 im N-terminalen Bereich selbst über ein PLA2 Motiv. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigten, dass die N-terminale Domäne von VP1 einen essentiellen Beitrag zur MVMp induzierten Zelllyse leistet. Rekombinante MVMp Viren, die für den N-terminalen VP1 Bereich kodierten, wiesen im Vergleich zu Viren, die ausschließlich die NS Proteine exprimierten, eine stark erhöhte lytische Aktivität auf. Experimente mit rekombinanten Viren, die eine inaktivierende Mutation in der katalytischen Domäne dieses PLA2 Motivs enthielten, ließen jedoch darauf schließen, dass der Beitrag dieses Motivs zur Zelllyse nicht in seiner enzymatischen Aktivität begründet ist. Dieses Ergebnis ließ als Ursache für die beobachtete massive Freisetzung von Arachidonsäure (AA) nach der MVMp Infektion, eine Aktivität zellulärer PLA2 vermuten. AA ist ein gängiges Produkt der PLA2 katalysierten Phospholipidhydrolyse und konnte, korrelierend mit der virusinduzierten Zelllyse, im Kulturüberstand infizierter Zellen detektiert werden. Dass es sich hierbei nicht um einen Nebeneffekt der Zelllyse, sondern einen enzymatisch regulierten Prozess in den noch intakten Zellen handelte, konnte durch den Nachweis einer virusinduzierten, starken Freisetzung von Prostaglandin E2, einem Produkt des AA Metabolismus, bekräftigt werden. In anschließenden Experimenten konnte unter Verwendung etablierter selektiver PLA2 Inhibitoren sowohl die virusinduzierte AA-Freisetzung als auch die Zelllyse gehemmt werden. Die genaue Untersuchung im Hinblick auf die Aktivierung dieser Enyzme ergab, dass cPLA2 infolge der MVMp Infektion an einer für die katalytische Aktivität essentiellen Phosphorylierungsstelle phosphoryliert wird und an intrazellulären Membrankompartimenten akkumuliert. Der Nachweis einer Aktivierung von p38 und p44/42 MAPK, einem der cPLA2 Phosphorylierung vorgeschalteten Ereignis, bestätigte dieses Ergebnis. Während ein Beitrag zellulärer iPLA2 ausgeschlossen wurde, konnte die Bedeutung zellulärer sekretorischer sPLA2 hingegen nicht vollständig klargestellt werden. Basierend auf den hier gezeigten Ergebnissen muss davon ausgegangen werden, dass die MVMp Infektion keine Sekretion des Enzyms hervorruft. Eine intrazelluläre Funktion einzelner sPLA2 Subtypen konnte allerdings nicht ausgeschlossen werden. Des Weiteren geben Untersuchungen mit einem in den NS Proteinen mutierten, hypolytischen MVMp Virus Hinweise darauf, dass auch die viralen NS Proteine eine wichtige Rolle in der MVMp induzierten Zelllyse spielen, da die bei einer wildtyp MVMp Infektion nachgewiesene Stimulation der MAPK und Aktivierung der cPLA2 bei einer Infektion mit diesem Virus ausbleiben. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass cPLA2 Enzyme, als zelluläre Faktoren, und die N-terminale Domäne des VP1 Proteins, als viraler Faktor, erheblich zur Parvovirus MVMp induzierten Zelllyse beitragen.

Translation of abstract (English)

The autonomous parvovirus Minute Virus of Mice (MVMp) is an oncolytic virus that selectively infects and finally kills neoplastic transformed cells. Several cytotoxic effects induced by MVMp infections are attributed mostly to activities of the viral NS1 protein. However, the cause of MVMp induced cell lysis and its mechanism are not known yet. Therefore, the aim of this work was to identify further viral and cellular factors involved in the lytic process. Phospholipase A2 (PLA2) enzymes, which are divided in secretory sPLA2, cytosolic cPLA2, and Ca2+ independent iPLA2, appeared to be promising candidates. On the one hand, PLA2 enzymes catalyze the hydrolysis of phospholipids and are therefore involved in both the production of signal transducers and severe changes in cellular membranes. On the other hand, the parvoviral capsid protein VP1 contains a PLA2 motif itself in its N-terminal domain. Indeed, it is shown here for the first time that the N-terminal domain of the viral VP1 protein is essentially contributing to MVMp induced cell lysis. Recombinant MVMp viruses encoding the N-terminal VP1 domain exhibited a strongly enhanced lytic acitivity compared to viruses encoding only the viral NS proteins. However experiments with recombinant viruses containing an inactivating mutation in the catalytic domain of the PLA2 motif provided evidence that the contribution of this domain to cell lysis is not based on its enzymatic acitivity. Thus, it was assumed, that the substantial release of Arachidonic acid (AA) after MVMp infection is caused by cellular PLA2. AA is a prevalent product of phospholipid hydrolysis by PLA2. In correlation with induction of cell lysis, AA could be detected in the culture supernatant of infected cells. This was not a mere side effect of cell lysis, but due to an enzymatically regulated process still in the intact cell, as was confirmed by demonstrating a virus induced, strong release of Prostaglandine E2, a product of the AA metabolism. In further experiments MVMp induced AA release as well as cell lysis could be strongly reduced by the application of established selective inhibitors of cellular cPLA2. Investigations on the activation of these cellular enzymes actually showed that cPLA2 became phosphorylated at a specific phosphorylation site known to be essential for the catalytic acitivity of the enzyme. As one more sign of acitivation, cPLA2 translocated from the cytoplasm to perinuclear, membraneous compartments in the cell. p38 and p44/42 MAPK activation, an essential upstream event of cPLA2 phosphorylation, was proven and confirmed this result. While a role of cellular iPLA2 in MVMp induced cell lysis was ruled out, the role of cellular sPLA2 is still not completely clear. Based on the results of various experimental trials, sPLA2 is probably not secreted upon MVMp infection. However, an intracellular function of particular sPLA2 subtypes could not be excluded. Furthermore, using a hypolytic MVMp virus, mutated in the NS coding region, indicates that also the viral NS proteins play an important role in MVMp induced cell lysis, since an infection with this virus does not result in MAPK stimulation and cPLA2 phosphorylation. The on hand study is demonstrating the first time that cPLA2 enzymes, as cellular factors and the N-terminal domain of the viral VP1 proteins, as viral factors, have a striking impact on MVMp induced cell lysis.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kleinschmidt, Dr.rer.nat Jürgen
Date of thesis defense: 5. July 2005
Date Deposited: 22. Aug 2005 07:23
Date: 2005
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Phospholipase A2, Lyse <Biologie>, Mice minute virus, Arachidonsäure
Uncontrolled Keywords: Parvoviren , onkolytische Viren , Zelllyse
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