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Zelluläre Regulation von Leben und Tod durch Todeseffektordomänen (DED)-enthaltende Proteine: CAP3, c-FLIP R und p22-FLIP

Golks, Alexander

English Title: Cellular regulation of life and death via death effector domain (DED)-containing proteins: CAP3, c-FLIP R and p22-FLIP

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Abstract

Die Apoptose als programmierter Zelltod spielt eine bedeutende Rolle bei der Ontogenese und Homöostase von mehrzelligen Organismen. CD95 (Fas, APO-1) ist einer von acht bislang identifizierten Rezeptoren, die direkt Apoptose auslösen können und als Todesrezeptoren (engl.: death receptor, DR) bezeichnet werden. CD95-vermittelte Apoptose ist von entscheidender Bedeutung für die Homöostase des Immunsystems. Fehlregulationen im CD95-System tragen außerdem zur Entstehung von Krankheiten wie Autoimmunität, Krebs oder AIDS bei. Bei der initialen Regulation Todesrezeptor-vermittelter Apoptose spielen vor allem Proteine eine Rolle, die sich durch das Vorhandensein von Todeseffektordomänen (DEDs) auszeichnen. Es sind sowohl pro-apoptotische als auch anti-apoptotische DED-enthaltende Proteine bekannt. Zu den pro-apoptotischen DED-enthaltenden Proteinen gehören u.a. Procaspase-8 und -10, während die c-FLIPs (engl.: cellular FLICE inhibitory proteins) zu den wichtigsten anti-apoptotischen DED-enthaltenen Proteinen gehören. Das CD95-vermittelte Todessignal wird nach Aktivierung des Rezeptors durch Anlagerung von cytosolischen Signalmolekülen mit DED-Domänen übertragen. Durch Bindung des CD95-Liganden wird CD95 oligomerisiert, und es bildet sich ein Tod-induzierender Signalkomplex (engl.: death-inducing signaling complex, DISC). In den CD95-DISC werden sowohl die pro-apoptotischen DED-Proteine wie Procaspase-8 als auch die anti-apoptotischen DED-Proteine wie c-FLIPs rekrutiert und abhängig von ihrem Mengenverhältnis zueinander wird der Prozess der Apoptose initiiert oder blockiert. Nicht nur in CD95-vermittelter Apoptose spielen DED-enthaltende Proteine eine Rolle. Es spricht immer mehr dafür, dass DED-Proteine zusätzliche Funktionen bei der Kontrolle zellulärer Aktivierung sowie Proliferation innehaben. Somit charakterisiert die DED-Domäne eine Familie von Proteinen, die wichtig für die Regulation zellulärer Homöostase sind und Proliferation und Apoptose zugleich regulieren können. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das bislang nicht identifizierte DED-enthaltende Protein CAP3 (engl.: cytotoxicity-dependent APO-1 associated protein 3) während der Prozessierung von Procaspase-8 im DISC gebildet wird. Dabei scheint Procaspase-8-Aktivität eine wichtige Rolle zu spielen. Wenn Procaspase-8 zur aktiven Caspase-8 prozessiert wird, findet eine Weiterspaltung von CAP3 in die bekannte Prodomäne von Procaspase-8 statt. Damit wurden neue Erkenntnisse zum entscheidenden Prozess der Aktivierung von Procaspase-8 und damit zu initialen Ereignissen bei der Induktion Todesrezeptor-vermittelter Apoptose gewonnen. Zudem wurde nach weiteren DED-enthaltenden Regulatoren zellulärer Homöostase gesucht und dabei zwei neue c-FLIP-Proteine gefunden: c-FLIPR und p22-FLIP. C-FLIPR wurde als eine neue kurze c-FLIP-Spleißvariante identifiziert, während p22-FLIP ein bisher unbekanntes Spaltprodukt von c-FLIP darstellt. C-FLIPR ist in verschiedenen T- und B-Zelllinien sowie in primären humanen T-Zellen vorhanden. Es enthält ebenso wie die bekannte Spleißvariante c-FLIPS Tandem-DEDs als N-Terminus und einen kurzen C-Terminus. C-FLIPR kann an den CD95-DISC rekrutiert werden und zeigt inhibitorische Funktion bezüglich Todesrezeptor-induzierter Apoptose. Wie c-FLIPS zeichnet es sich durch eine kurze Halbwertszeit und ein ähnliches Expressionsprofil nach Aktivierung und T-Zell-Rezeptor-Restimulation in primären humanen T-Zellen aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres c-FLIP-Protein entdeckt, p22-FLIP. Nach der Identifizierung von p22-FLIP als Spaltprodukt und N-Terminus von c-FLIP-Proteinen wurde p22-FLIP in funktioneller wie mechanistischer Weise charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass p22-FLIP durch die Aktivität von Procaspase-8 im Cytosol unter nicht-apoptotischen Bedingungen geschnitten wird. Außerdem wurde gezeigt, dass p22-FLIP eine inhibitorische Funktion bei Todesrezeptor-vermittelter Apoptose innehat und gleichzeitig sehr effizient die Aktivität des nukleären Faktors B (NFB) und damit Überlebens-Signalleitung induzieren kann. Damit konnte p22-FLIP als ein wichtiger Parameter für zelluläre Homöostase identifiziert werden, der ähnlich wie virale FLIPs wichtige Prozesse wie Proliferation und Apoptose regulieren kann. Die Fehlregulation von Proliferation und Apoptose ist wahrscheinlich eine entscheidende Voraussetzung für Tumorentstehung und -progression.

Translation of abstract (English)

Apoptosis, programmed cell death, plays an important role in oncogenesis and tissue homeostasis of multicellular organisms. CD95 (Fas/APO-1) is a member of a family containing eight receptors capable of directly inducing apoptosis, the so-called death receptors. CD95-mediated apoptosis is critical for homeostasis of the immune system. Dysregulation of CD95-mediated apoptosis contributes to the pathophysiology of several diseases, such as autoimmune syndromes, cancer, or AIDS. The death effector domain (DED) occurs in proteins that are involved in the regulation of the initial events in death receptor-mediated apoptosis. Both pro- and anti-apoptotic proteins containing DEDs have been identified. Procaspases-8 and -10 are known as pro-apoptotic DED-containing proteins, whereas cellular FLICE-inhibitory proteins (c-FLIPs) are important anti-apoptotic DED-containing proteins. The CD95-induced death signal is transduced by recruitment of cytosolic DED-containing proteins. Binding of the CD95 ligand to CD95 leads to the formation of the death-inducing signaling complex (DISC). Pro-apoptotic DED-containing proteins such as procaspase-8 as well as anti-apoptotic DED-containing proteins such as c-FLIPs are recruited to the DISC and the ratio of pro-apoptotic to anti-apoptotic proteins is decisive for induction or inhibition of apoptosis. Accumulating evidence now suggests that DED-containing proteins have additional roles in controlling pathways of cellular activation and proliferation. Thus, the DED domain defines a family of proteins that may be pivotal to cellular homeostasis by coregulating proliferation and apoptosis in parallel. In this thesis it has been demonstrated that the so far unidentified DED-containing protein CAP3 is an intermediate of procaspase-8 processing in the CD95 DISC. Procaspase-8 activity is needed for the generation of CAP3 and it was shown that CAP3 is subsequently processed into the known prodomain of procaspase-8 by the activity of mature caspase-8. These findings lead to new insights into the mechanism of procaspase-8 processing and apoptosis initiation. In addition, this study reveals the existence of two novel c-FLIP proteins, c-FLIPR and p22-FLIP. C-FLIPR was identified as a new short c-FLIP splice variant whereas p22-FLIP turned out to be a novel cleavage product of c-FLIP. In addition, this study demonstrates the presence of c-FLIPR in a number of T and B cell lines as well as in primary human T cells. Like c-FLIPS, it contains N-terminal Tandem-DEDs and a short C-Terminus. C-FLIPR is recruited to the CD95-DISC upon CD95 stimulation where it can act as an inhibitor of death receptor-mediated apoptosis. Several properties of c-FLIPR are similar to c-FLIPS: both isoforms have a short half-life, a similar pattern of expression during activation of primary human T cells, and are strongly induced in T cells upon T cell receptor restimulation. In this study, another c-FLIP protein was found, p22-FLIP. P22-FLIP was identified as an N-terminal cleavage product of c-FLIP proteins. In addition, this new cleavage product was characterized both, in functional and mechanistical terms. It was shown that generation of p22-FLIP is mediated by procaspase-8 activity and occurs under non-apoptotic conditions in the cytosol. An inhibitory function of p22-FLIP in death receptor-mediated apoptosis was observed as well as the property to induce NFB activity with high efficiency and thereby pro-survival signaling. The induction of NFB activity is mediated by direct binding to the IKK complex. Taken together, p22-FLIP was identified as an important regulator of proliferation and apoptosis, and thus, cellular homeostasis. Its deregulation might contribute to processes such as tumor development and tumor progression.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Krammer, Prof. Dr. Peter H.
Date of thesis defense: 20 September 2005
Date Deposited: 29 Sep 2005 13:57
Date: 2005
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Apoptosis, Signaltransduktion
Uncontrolled Keywords: FLIP , Caspase-8 , CAP3apoptosis , cell death , signal transduction , caspase-8 , FLIP
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