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Expression Profiling by DNA Microarrays : Development of Amplification Methods for the Analysis of Minimal Tumor Samples

Schlingemann, Jörg

German Title: Expression Profiling mit DNA Microarrays : Entwicklung von Amplifikationsmethoden für die Untersuchung kleinster Tumorproben

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PDF, German
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Abstract

Recently, microarrays of synthetic long sense-oriented oligonucleotides were introduced as an alternative expression profiling platform with distinct advantages to both cDNA arrays and commercial arrays produced by in situ synthesis of multiple short oligonucleotides per gene. However, gene expression analysis using microarrays of long oligonucleotides is limited in that it requires substantial amounts of RNA. The objective of this thesis was to develop protocols that allow for the analysis of gene expression even in minimal samples. Two different approaches were taken, one that amplifies the RNA target material before hybridization and another that amplifies the signal generated on the array. Most existing target amplification protocols linearly amplify mRNA by cDNA synthesis and in vitro transcription. Since orientation of the product is antisense (aRNA), it is inapplicable for dye-labeling by reverse transcription and hybridization to sense-oriented oligonucleotide arrays. Here, a novel protocol (TAcKLE) is introduced in which a combination of two reverse and one forward transcription reactions followed by dye-incorporation using the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I generates fluorescent antisense cDNA. This protocol provides high fidelity and up to 105-fold amplification, starting from 2 ng total RNA. The generated data are highly reproducible and maintain relative gene expression levels between samples. Signal amplification is another option if only minimal amounts of sample material are available. Therefore, a method was evaluated that uses on-chip rolling circle replication of circularized oligonucleotides for the amplified detection of gene expression profiles. This principle should allow for a faster and cheaper experimental procedure, circumventing sequence-dependent amplification bias. The preliminary results provide evidence for the method’s applicability, but further experiments are required to reduce the required amount of starting material and to define a stable protocol. As the TAcKLE protocol performed particularly well, it was subsequently applied to evaluate the utility of spotted oligonucleotide microarrays compared to a widely-used and accepted commercial reference platform. There are numerous ways to perform global transcriptional profiling, among which microarray technology has certainly gained a premier position. The comparison of gene expression measurements obtained with different array-based approaches is therefore of substantial interest in order to clarify whether inter-platform differences may conceal biologically significant information. To address this concern, global gene expression was analyzed in a set of clinical head and neck squamous cell carcinoma samples, using both spotted oligonucleotide microarrays made from a large collection of 70-mer probes and commercial arrays produced by in situ synthesis of sets of multiple 25-mer oligonucleotides per gene. Expression measurements were compared for 4,425 genes represented on both platforms, which revealed strong correlations between the corresponding data sets and similar profiles of relative gene expression. In conclusion, combining the TAcKLE protocol with spotted oligonucleotide arrays is an attractive alternative for transcriptional profiling of limited source material, offering a high potential for gene expression analysis in a multitude of disease situations.

Translation of abstract (German)

Microarrays bestehend aus langen, sense-orientierten Oligunukleotiden sind seit kurzem als eine Alternative zu cDNA-Arrays und Arrays kurzer, in-situ-hergestellter Oligonukleotide erhältlich, welche deutliche Vorteile zu beiden anderen Systemen aufweisen. Das Spektrum wissenschaftlicher Fragestellungen, das mit Hilfe dieser neuartigen Microarray-Technologie bearbeitet werden kann, ist allerdings limitiert durch die großen RNA-Mengen, die für die Experimente benötigt werden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Methoden, die das Erstellen von Genexpressions-profilen auch bei Fragestellungen mit limitierter RNA-Menge erlauben. Es wurden hierzu zweierlei Ansätze gewählt, nämlich einerseits die Amplifikation des Ausgangs-materials, und andererseits die Verstärkung des Signals direkt auf dem Array. Etablierte Amplifikationsprotokolle schreiben die zu analysierende mRNA zunächst in cDNA um und amplifizieren sie anschließend durch in-vitro-Transkription. Sie produzieren so allerdings RNA in antisense-Orientierung, die nach reverser Transkription in fluoreszenzmarkierte, sense-orientierte cDNA nicht auf sense-orientierte Oligonukleotid-Sonden hybridisiert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein neuartiges Protokoll (TAcKLE) entwickelt, in welchem eine Kombination von zwei reversen Transkriptionen, einer nicht-reversen Transkription und einer Markierungsreaktion mittels Klenow-Fragment fluoreszenzmarkierte cDNA in antisense-Orientierung erzeugt. Die mit diesem Protokoll generierten Daten sind reproduzierbar und geben relative Expressionsniveaus wahrheitsgemäß wieder. Der maximale Amplifikationsfaktor liegt bei 105, bei einer minimalen Ausgangsmenge von lediglich 2 ng gesamt-RNA. Eine weitere Option bei limitiertem Untersuchungsmaterial ist die Verstärkung des Signals, welches auf dem Array generiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode erarbeitet, bei der diese Signalamplifikation durch in-situ-Replikation zirkulärer Oligonukleotide (rolling circle replication) auf dem Array erzielt wird. Dieses Prinzip ermöglicht eine schnellere und billigere Durchführung der Experimente und vermeidet sequenzbedingte Verzerrungen der Ergebnisse. Weiterführende Experi-mente sind allerdings notwendig, um den Amplifikationsfaktor zu erhöhen und ein stabiles Protokoll zu etablieren. Da mit dem TAcKLE-Protokoll besonders gute Ergebnisse erzielt worden waren, wurde es im Anschluss verwendet, um die Nützlichkeit und Leistungsfähigkeit selbst hergestellter Oligonukleotid-Microarrays im Vergleich zu einem etablierten, kommerziellen System zu untersuchen. Es gibt verschiedenste Methoden für eine globale Expressionsanalyse, unter welchen die Microarray-Technologie sicherlich am häufigsten zum Einsatz kommt. Der Vergleich von Expressionsprofilen, die mit unterschiedlichen Varianten dieser Methodik erstellt wurden, sollte klären, ob plattformspezifische Unterschiede biologische Daten überlagern können. Es wurden diesbezüglich die Genexpressionsprofile von sechs HNSCC-Tumoren bestimmt, und zwar sowohl mittels selbst produzierter 70-mer Oligonukleotid-Microarrays, die pro Gen nur ein Sondenmolekül verwenden, als auch über kommerzielle, durch in-situ-Synthese hergestellte Arrays, auf denen pro Gen mehrere 25-mer-Oligonukleotide aufgebracht sind. Die Expressionsdaten wurden verglichen für insgesamt 4.425 Gene, die auf beiden Plattformen vertreten waren. Die Korrelationen unter den Datensätzen waren sehr gut, und es wurden mit beiden Ansätzen sehr ähnliche Genexpressionsprofile erhalten. Die Kombination aus TAcKLE-Protokoll und selbst produzierten 70-mer-Arrays ist somit eine attraktive Alternative für die Expressionsanalyse von limitiertem Probenmaterial, deren hohes Potential für die wissenschaftliche Untersuchung bei einer Vielzahl von Erkrankungen Verwendung finden kann.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rippe, Dr. PD Karsten
Date of thesis defense: 30. September 2005
Date Deposited: 06. Oct 2005 07:08
Date: 2005
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Micorarrays, Expression Profiling, RNA-Amplifikation, Signalamplifikation, Plattformvergleich
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