German Title: Strukturelle Untersuchungen der Ets1 und USF1 Transkriptionsfaktoren Komplexe mit DNA

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Abstract

Ets1 und USF1 sind Transkriptionsfaktoren, die in der Regulierung der Transkription unter der Kontrolle von viralen und zellulären Promotoren eine wichtige Rolle spielen. Ets1 besitzt eine 85 Aminosäuren lange konservierte Domäne, die eine DNA Bindedomäne ist und Ets Domäne genannt wird. Diese ist von zwei autoinhibierenden Regionen umgeben. Die Autoinhibition findet statt, wenn Ets1 an DNA gebunden ist. Est1 bindet an zwei Ets1-Bindemotive auf dem Stromelysin-1 Promotor und und bedingt so eine Transaktivierung. Stromelysin-1 (auch genannt Matrix-metalloproteinase-3) gehört zu den Matrix Metalloproteinasen, die wichtige Rollen bei Gewebegenerierung, Wachstum und Wundheilung (Sternlicht et. al., 1999) spielen. Weil die Missregulierung von Stromelysin-1 pathologische Prozesse hervorruft und Ets1 eine Rolle in der Regulation des Stromelysin-1 Promotor spielt, ist es von hohem Interesse, den Mechanismus der Ets1/Ets1/DNA Komplex bildung zu verstehen. Ein Modell des Ets1/Ets1/DNA-Komplexes basierend auf Daten erhalten aus einem Röntgenkleinwinkelstreuexperiments (SAXS) konnte erstellt werden. Weiterhin wurde der Komplex wurde mit Hilfe der Dampfdiffusionsmethode kristallisiert. Ein Röntgenstreudatensatz mit einer Auflösung von 2.58 Å konnte aufgenommen werden. Die dreidimensionale Struktur des Komplexes wurde dann mit der Methode des Molekularen Ersatzes gelöst. Das SAXS Modell ist vergleichbar mit der Kristall Struktur. Von der distalen Verstärker-Region des humanen Immunschwäche Virus 1 (HIV1) des langen terminalen Repeat LTR (-130 to -160) weiss man, dass es wichtig für die Transkriptionsaktivität und für die virale Replikation in T-Zellen ist (Sieweke et. al., 1998). Die DNA Sequenz der Region besitzt Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor USF1 (E-box) und für den Transkriptionsfaktor Ets1. Es gibt mehrere E-boxen auf HIV1 LTR, die USF1 an zwei Initiationselementen in der Nähe des Transkriptionstartelements auf HIV1 LTR binden kann (Du et. al., 1993). Es wurde vorgeschlagen, dass USF1 Homotetramere ausbilden kann (Ferre-D’Amare et. al., 1994). Außerdem wurde vorgeschlagen, dass die Bildung der bivalenten Homotetramere kann eine DNA Loop-Bildung provozieren kann. Dies wiederum kann zur Rekrutierung von USF1 und anderen Transkriptionsfaktoren der distalen Region des Promotor zum Initiatorelement führen. Der USF1 und USF1/DNA Komplex wurde mittels SAXS Experimenten untersucht. Ein ab initio Modell bei niedriger Auflösung des USF1 Monomers wurde mit Hilfe des Programms GASBOR erstellt. Ein vorläufiges Modell eines bivalenten Homotetramers wurde ebenfalls gebaut. Die Komplex weist die gleiche Position der Moleküle wie in der Struktur des Myc-Max Heterotetramers auf (Nair et. al., 2003). Um die USF1 Tetramerisierung experimentall zu überprüfen, wurden zwei weitere Methoden eingesetzt: Fluoreszenz Resonanz Energie Trransfer (FRET) und rotary shadowing Elektronenmikroskopie (EM). Allerdings konnte die USF1 Tetramerisierung weder mittels FRET noch mittels rotary shadowing EM bestätigt werden. Das E-box Bindeprotein USF1 wurde wie auch der Wechselwirkungspartner für Ets1 mit dem Hefe one-hybrid Screen Assay gefunden (Sieweke et. al., 1998). Die Wechselwirkung zwischen Ets1 und USF1 ist vermutlich für die Transkriptionsaktivität des HIV1 LTR in T-Zellen wichtig. Strukturelle Untersuchungen des Ets1/USF1/DNA wurden durchgeführt, allerdings wurden keine Kristalle erhalten.

Translation of abstract (English)

Ets1 and USF1 are transcription factors, which were shown to play a role in regulation of transcription on different viral and cellular promoters. Ets1 has a conserved 85 amino acids DNA binding domain termed as ETS domain surrounded by two autoinhibitory regions. Autoinhibition is released when Ets1 is bound to the DNA. Ets1 binds cooperatively to two Ets1-binding sites located on the human stromelysin-1 promoter and transactivate it (Baillat et. al., 2002). Stromelysin-1 (matrix metalloproteinase-3) is a major matrix metalloproteinase of connective tissue and is important for tissue remodeling during tissue development, growth, and wound repair (Sternlicht et. al., 1999). Since, stromelysin-1 misregulation can lead to pathological processes development and the Ets1 protein is involved in regulation of stomelysin-1 promoter, understanding of the mechanism of Ets1/Ets1/DNA complex formation is of interest. Small angle X-ray scattering (SAXS) model for Ets1/Ets1/DNA complex was built. The complex was crystallized. The data set was collected to a resolution of 2.58 Å. The structure was solved by molecular replacement. SAXS model is in a good agreement with crystal structure. The distal enhancer region of the human immunodeficiency virus 1 (HIV1) long terminal repeat LTR (-130 to -160) is known to be important for transcriptional activity and viral replication in T cells (Sieweke et. al., 1998). The DNA sequence of this region contains binding sites for the transcription factor USF1 (E-box) and for the transcription factor Ets1. It has been shown that besides the E-box in the distal enhancer, USF1 can bind to two initiator-type elements near the transcription start site of the HIV1 LTR (Du et. al., 1993). Based on spectroscopic and biochemical evidence it has been proposed that USF1 can form homotetramers when bound to two recognition sequences (Ferre-D’Amare et. al., 1994). It was proposed that formation of the bivalent homotetramer may lead to the DNA looping recruiting USF1 and other factors from the distal region of the promoter to the initiator element. USF1 and USF1/DNA complex were investigated in SAXS experiments. Low resolution ab initio model of USF1 monomer was reconstructed using GASBOR program. The tentative model of USF1/DNA bivalent homotetramers was built. It displayed the dimers arrangement similar to the crystallographic structure of Myc-Max heterotetramer (Nair et. al., 2003). In order to validate tetrameriation two other methods were used. They were fluorescence resonance energy transfer (FRET) and rotary shadowing electron microscopy (EM). USF1 tetramerization was not proved by FRET experiment and by rotary shadowing EM. Based on yeast one-hybrid screen assay the E-box binding protein USF1 was identified as an interaction partner of Ets1 (Sieweke et. al., 1998). The interaction between USF1 and Ets1 was claimed to be important for full transcriptional activity of HIV1 LTR in T cells. Structural studies on Ets1/USF1/DNA ternary complex were done. Unfortunately, no crystals were obtained.