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Entwicklung biofunktionalisierter Nanostrukturen an Grenzflächen zur Untersuchung der Kinetik des molekularen Motorproteins Eg5

Blümmel, Jacques

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PDF, German
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Abstract

Motorproteine transportieren Makromoleküle oder Molekülverbände durch Umwandlung von chemischer in mechanische Energie. Homotetramere Motorproteine der Kinesin-5-Familie sind essentiell an der Bildung des Spindelapparats während der Mitose beteiligt. Ihre Fähigkeit, Mikrotubuli zu vernetzen, erschwerte bislang gängige Untersuchungsmethoden. In dieser Arbeit wurde erstmals das Motorprotein Eg5 durch seine systematische Dichtevariation auf Oberflächen untersucht. Möglich wurde dies durch die Entwicklung eines neuen Verfahrens auf der Basis nanostrukturierter und biofunktionalisierter Grenzflächen. Finales Ziel dieser Arbeit war es, eine kontrollierte Anbindung des Motorproteins Eg5 auf einer biokompatiblen Oberfläche zu ermöglichen, um sein biologisches Verhalten quantitativ zu untersuchen. Für eine kontrollierte Anbindung der Biomoleküle auf einer Oberfläche mussten sowohl proteinadhäsive wie auch proteinresistente Bereiche mit hoher Symmetrie generiert werden. Erstere wurden mittels quasi-hexagonaler Goldnanostrukturen auf Glas und letztere durch Funktionalisierung der noch freien Glasoberfläche mit Polyethylenglykol (PEG) erzeugt. Diese PEG-Schicht sollte zum einen gute proteinresistente Eigenschaften vorweisen und zum anderen möglichst dünn sein, um eine Biofunktionalisierung der Goldnanopartikel zu gewährleisten. Die Goldpartikeldurchmesser (5-7 nm) wurden der Größe einer Motordomäne des Proteins angepasst. Dadurch wurde die Wahrscheinlichkeit einer Mehrfachbelegung eines Goldpunktes mit Eg5 minimiert. Zentrale Frage zur Entwicklung geeigneter Oberflächen war die Generierung proteinresistenter Filme. Hierfür wurden unterschiedliche PEG-Funktionalisierungen durchgeführt und ihre Schichtzusammensetzung und –dicke untersucht. Dabei zeigten sich deutliche Vorteile einer Funktionalisierung mittels PEG-Alkoxysilylderivaten im Gegensatz zur Kopplung von PEG an aktivierte Oberflächen zur Herstellung dünner Filme (< 2.5 nm). Im Hinblick auf die Proteinresistenz der erzeugten PEG-Schichten konnte zudem gezeigt werden, dass besonders im Falle dünner Filme Packungsdichten wie auch Präparationsmethoden maßgeblichen Einfluss auf ihre zellabstoßenden Eigenschaften haben. Zudem wurde anhand von Zelladhäsionsexperimenten verdeutlicht, dass mit zunehmender Schichtdicke des PEGs größere Abschirmung eingebetteter Goldnanostrukturen erfolgte. Im Mittelpunkt der Anwendung stand die Fragestellung, ob und in welcher Form die Partikeldichte das Verhalten des Motorproteins beeinflusst. Hierfür wurde Eg5 auf Goldnanostrukturen mit unterschiedlichen Partikelabständen (45, 58, 73, 90, 110 nm) eingebettet in eine PEG-Matrix immobilisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Eg5-Anbindung zum einen spezifisch auf diesen Partikeln erfolgt und zum anderen die Menge des immobilisierten Proteins in direktem Zusammenhang mit der vorgegebenen Partikeldichte steht. Die ermittelten Gleitgeschwindigkeiten von Mikrotubuli, welche aktiv durch Eg5 unter ATP-Verbrauch transportiert wurden, stiegen mit zunehmender Motorkonzentration auf der Oberfläche. Weiterhin konnte bei geringen Goldpunktdichten (110 nm Abstände) eine Zunahme der Gleitgeschwindigkeit mit wachsender Länge der Mikrotubuli beobachtet werden. Dieses Verhalten steht im Einklang mit der Dichteabhängigkeit der Nanopartikel: Je mehr Eg5 am Transport der Mikrotubuli beteiligt sind, umso schneller werden sie, bis eine Sättigung erreicht ist. Diese Erkenntnis lässt vermuten, dass es sich bei Eg5 um ein nicht prozessives Motorprotein handelt, d. h. nach jedem getätigten Schritt auf dem Filament löst es sich ab. Weitere Geschwindigkeitserhöhungen konnten durch Anheben der Salzkonzentration in den verwendeten Puffern erzielt werden, wobei die Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der Eg5-Oberflächenkonzentration gewahrt wurde. Diese Studie verknüpft anorganische Oberflächen mit organischen Beschichtungen zur Untersuchung biologischer Systeme mittels physikalischer Methoden. Sie eröffnet durch diese Symbiose der Naturwissenschaften neue Möglichkeiten in der Erforschung von Motorproteinen. Ebenso ist die Erweiterung auf andere molekulare Biosysteme wie DNA oder Enzyme denkbar.

Translation of abstract (English)

Many motor proteins function as carriers of macromolecules and molecular assemblies by transforming chemical into mechanical energy. Among these proteins, members of the kinesin-5 family are able to cross-link microtubules; for this reason, kinesin-5 motors play an essential role in spindle formation during cell division. However, in vitro assays to investigate the behaviour have been limited by the cross-linking properties up to now. Therefore, nanostructured and biocompatible interfaces allow, for the first time, to succesfully examine the behaviour of the molecular motor Eg5, a member of the kinesin-5 family, in dependence of its surface density. Final goal of this thesis was the controlled binding of the molecular motor protein Eg5 on biocompatible interfaces to study quantitatively biological behaviour. To achieve the controlled binding of biomolecules both protein adsorbing and repelling areas were arranged in an highly ordered array. Thus, hexagonal gold nano dot patterns on glass were used as anchor points for proteins whereas the space in between the gold dots was passivated with a protein resistant polyethylene-glycole (PEG) film. This film was supposed to be thin enough to enable biofunctionalisation of the nano particles. Particle sizes (5-7 nm in diametre) were adapted to the dimension of single motor domains to minimise the probability of multiple functionalisation. Development of suitable interfaces was based on generation of protein resistant films. Therefore, several PEG systems were investigated. Functionalisation with PEG was done in two different ways: with PEG after surface activation and with PEG alkoxysilane derivatives. The latter case showed big advantages in creating thin films (< 2.5 nm). For these thin films packing densities and preparation methods strongly influenced cell resistant properties. Furthermore, in cell adhesion experiments increasing PEG layer thickness caused higher shilding of the embedded nano structure. The main interest of the application was to determine how the density of the gold nano dots would influence biological behaviour of the molecular motor protein Eg5. Therefore, Eg5 was immobilized on gold arrays with different particle separations (45, 58, 73, 90, 110 nm) embedded in a protein resistant PEG matrix. This biofunctionalisation was showed to be specific to the gold particles. Thus, the amount of coupled Eg5 was related to the dot density. The gliding velocities of microtubules increased with the density of the gold dots and the surface concentration of Eg5 respectively. Furthermore, using high particle separation (110 nm) the motor velocities increased with microtubule length. This is in agreement with the particle density effect: The more Eg5 are involved in microtubules transport, the faster they are until a maximum speed is reached. With these results, Eg5 is supposed to be a non processive motor, i. e. the motor detaches from the filament after each step. A second velocity driving effect was observed with changing salt concentration in used buffers. However, the particle density effect on velocity was maintained. This study combines inorganic interfaces with organic coatings for biological investigations using physical methods. As such, the symbiosis of natural sciences enables new applications in motor protein research. Future investigations on other biological systems (e. g. Enzymes, DNA) are conceivable.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Spatz, Prof. Joachim P.
Date of thesis defense: 8 July 2005
Date Deposited: 12 Dec 2005 09:27
Date: 2005
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Nanostruktur, Molekularer Motor, Biokompatibilität
Uncontrolled Keywords: Biofunktionalisierung , Proteinresistenz , Zelladhäsion , Röntgenphotoelektronenspektroskopie , Eg5
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