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Entwicklung, Optimierung und Validierung eines Immunoassays zur sensitiven Detektion des endokrinen Disruptors 17alpha-Ethinylestradiol

Schneider, Christian

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PDF, German
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Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analytik von 17alpha-Ethinylestradiol (EE2) in der aquatischen Umwelt. Der Schwerpunkt der Untersuchungen lag dabei in der Entwicklung und Optimierung von Enyzm-Immunoassays (ELISAs) zur direkten Bestimmung des Analyten im Konzentrationsbereich von 1 - 10 Nanogramm pro Liter. Es wurden drei neue ELISAs für EE2 entwickelt. Für den ersten Assay (Bio-LC EE2 ELISA) wurde ein biotinyliertes Ethinylestradiolderivat synthetisiert und im ELISA als Tracer verwendet. Durch Verwendung eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats und Ausnutzung der Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung wurde anschließend Peroxidase an den Biotin-Tracer gebunden. Im zweiten Assay (EE2 ELISA) wurde ein direktes Enzymkonjugat des EE2 mit Meerrettichperoxidase synthetisiert. Dieses fungierte im EE2 ELISA als Tracer. Die Detektion erfolgte auch hier photometrisch. Im Vergleich zum Bio-LC EE2 ELISA wurde im EE2 ELISA das Protokoll vereinfacht und der Zeitbedarf konnte von 120 auf 70 Minuten reduziert werden. Der dritte Assay (EE2 CLEIA) leitete sich unmittelbar vom EE2 ELISA ab, es wurde das gleiche Enzymkonjugat verwendet. Zur weiteren Sensitivitätssteigerung wurde die Antikörperverdünnung von 1:50.000 auf 1:200.000 , und die Tracerverdünnung von 1:50.000 auf 1:500.000 erhöht. Eine typische Messung von 24 Realproben mit dem Chemilumineszenzassay (EE2 CLEIA) dauert nur noch 40 Minuten. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenze (LOD bzw. LOQ), sowie die Messbereiche der drei Assay betragen: Bio-LC EE2 ELISA: LOD 2,6 ng/L / LOQ 21 ng/L / Messbereich 0,025 – 55 µg/L EE2 ELISA: LOD 0,5 ng/L / LOQ 6,0 ng/L / Messbereich 0,004 – 130 µg/L EE2 CLEIA: LOD 0,2 ng/L / LOQ 1,4 ng/L / Messbereich 0,8 –100 ng/L Diese drei Assays gehören damit zu den derzeit vier empfindlichsten Immunoassays für die Bestimmung von EE2. Mit Hilfe des EE2 CLEIA konnten erstmalig direkte Messungen im ökotoxikologisch relevanten sub ppt-Bereich realisiert werden. Neben der Steigerung der Assaysensitivität wurde eine umfassende Studie zur Selektivität und Stabilität der Assays durchgeführt. Zur Untersuchung der Selektivität dienten elf Steroidhormone bzw. Hormonderivate, darunter die häufig in Umweltproben vorliegenden Substanzen Estron und Estradiol. Das EE2-Antiserum zeigte hierbei ein extrem selektives Bindungsverhalten bezüglich EE2. Typische Kreuzreaktivitäten, beispielsweise für Estron und Estradiol, lagen zwischen 0,1 und 0,3 %. Nennenswerte Kreuzreaktivitäten traten lediglich für Konjugate des EE2 an der Ringposition drei auf (Glucuronsäureaddukte: 17-22 % und Sulfate: 34-37 %). Dies steht in Zusammenhang mit der Struktur des für die Immunisierung verwendeten BSA Konjugats des EE2. Die Matrixstabilität der ELISAs wurde anhand eines kommerziellen Huminsäurepräparates untersucht. Der Bio-LC EE2 ELISA erwies sich als störungsanfällig und nicht stabil bezüglich der verwendeten Huminsäure. Im Gegensatz dazu zeigte der EE2 ELISA und EE2 CLEIA ein robustes Verhalten und ermöglichten auch in Gegenwart erhöhter Huminsäurekonzentrationen die zuverlässige Bestimmung des EE2. Zusätzlich zu Aufbau und Optimierung der ELISAs wurde, ausgehend von bekannten Verfahren, eine SPE-Methode (solid phase extraction) zur Anreicherung und Aufreinigung von Wasserproben modifiziert und weiterentwickelt. Der wesentliche Vorteil der neuen Methode besteht in der geringeren Belastung der Extrakte durch Matrixkomponenten. Dies wurde ermöglicht durch die Verwendung eines neutralen pH-Werts zur Anreichung der Proben und der Einbeziehung spezieller Waschschritte mit organischen Lösungsmitteln zur Entfernung der Huminstoffe. Abschließend wurde die Praxistauglichkeit des EE2 ELISA und EE2 CLEIA im Rahmen einer Feldstudie untersucht und durch den Vergleich zu einem Referenzlabor validiert. Insgesamt wurden acht Proben aus Fließgewässern und zwölf Proben aus Kläranlagenabläufen gemessen. Für die Flussproben ergab sich eine Mediankonzentration von 0,6 ng/L und für die Proben aus Kläranlagenabläufen von 1,3 ng/L. Die Ergebnisse der Referenzmessungen (LC-MS/MS, LOD 1,0 ng/L) führten, bedingt durch die zu hohe Nachweisgrenze, meist zu (falsch-)negativen Befunden. Durch die vorliegende Arbeit konnte die Nachweisgrenze zur direkten Bestimmung von EE2 in Wasserproben (Oberflächenwasser und Kläranlagenablauf) erstmalig auf bis zu 0,2 ng/L abgesenkt werden. Gleichzeitig ist es gelungen, die Materialkosten für eine solche Bestimmung auf ca. 1,20 EUR zu reduzieren und die parallele Messung von 24 Proben in 40 Minuten zu ermöglichen. Es wurden somit die Grundlagen für eine sensitive und zugleich kosteneffiziente Routinemethode zur Bestimmung von EE2 in der aquatischen Umwelt geschaffen.

Translation of abstract (English)

This thesis deals with the analysis of 17alpha-ethinylestradiol (EE2) in the aquatic environment. The study was focused on the development and optimization of enzyme immunoassays (ELISAs) for the direct quantitation of EE2 at a concentration range of 1 - 10 ng/L. The optimization of the ELISAs relied on the concept of affinity limitation. Affinity limitation describes the observation that an improvement of assay sensitivity with hapten immunoassays is restricted by intrinsic properties of the antibody itself. After the first studies using an established ELISA for estradiol three new ELISAs for EE2 were developed. Each of these assays employed the same polyclonal antiserum. For the first assay (Bio-LC EE2 ELISA) a new biotinylated EE2 derivative was synthesized and used as tracer. In this assay a conjugate of peroxidase and streptavidin acted as enzyme label. The binding of this enzyme conjugate relied on the biotin-streptavidin interaction with the biotin moiety of the tracer. Measurements were performed photometrically, using a substrate based on tetramethylbenzidine and hydrogenperoxide. For the second assay (EE2 ELISA) a conjugate of EE2 and peroxidase was synthesized and used directly as tracer. For measurements the same photometric detection as employed in the Bio-LC EE2 ELISA was used. Compared to the first assay, introduction of the EE2 ELISA simplified the protocol and reduced the expenditure of time from 120 to 70 minutes. Optimization of the EE2 ELISA lead to the development of the third assay, the EE2 CLEIA. For achieving improved assay sensitivities, dilutions of the antibody were raised from 1:50,000 (EE2 ELISA) to 1:200,000 (EE2 CLEIA), dilutions of the tracer from 1:50,000 to 1:500,000, respectively. Loss of signal intensities due to these lowered concentrations required the substitution of the photometric measurement by a chemiluminescence based detection. This enabled further optimizations of assay sensitivity and reduced the expenditure of time for measurement of a typical set of 24 samples to 40 minutes. Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) as well as the analytical range of these three assays are: Bio-LC EE2 ELISA: LOD 2.6 ng/L / LOQ 21 ng/L / analytical range 0.025 – 55 µg/L EE2 ELISA: LOD 0.5 ng/L / LOQ 6.0 ng/L / analytical range 0.004 – 130 µg/L EE2 CLEIA: LOD 0.2 ng/L / LOQ 1.4 ng/L / analytical range 0.8 –100 ng/L These assays are currently among the four most sensitive assays for EE2. Introduction of EE2 CLEIA facilitated for the first time the direct detection of EE2 at ecotoxicologically relevant concentrations. Apart from improving assay sensitivity a thorough study regarding selectivity and stability was conducted. Eleven hormones, including the derivatives estrone and estradiol frequently occurring in environmental samples, were used for characterizing the selectivity. Typical cross reactivities were below 0.3 %. Lower selectivities were observed for conjugates of EE2 at ring position 3 (glucuronides: 17-22 % and sulfates: 34-37 %). This can be explained by the steric requirements of the BSA conjugate used during the immunization. Stability of the ELISAs against matrix interference was studied using commercially available humic acids. The Bio-LC EE2 ELISA appeared to be susceptible to this interference and had to be regarded as not stable. In contrast the EE2 ELISA and EE2 CLEIA, respectively, exhibited a very robust behaviour and enabled reliable determinations of EE2 even in the presence of elevated concentrations of humic acid. In addition to assay development and optimization an established SPE (solid phase extraction) method was modified and improved. Using a neutral pH for sample enrichment and employing washing steps with organic solvents significantly lowered the matrix content of the extracts. Usability of both, EE2 ELISA and EE2 CLEIA, was examined in a field study including eight samples from surface waters and twelve final effluent samples of sewage treatment plants. Results were validated using a reference method based on LC-MS/MS (LOD 1.0 ng/L). The median concentration for surface waters was 0.6 ng/L, effluent samples had a median concentration of 1.3 ng/L. Due to the elevated limit of detection of the reference method, LC-MS/MS measurements frequently lead to (false-)negative results. With this thesis the limit of detection for a direct measurement of EE2 in water samples could be established for the first time at 0.2 ng/L. In parallel consumption of resources could be significantly reduced. 24 samples can be measured within 40 minutes at costs per sample of only 1.20 EUR. These new immunoassays enable an economically efficient and very sensitive determination of EE2, yielding the possibility for a routine monitoring of EE2 in the aquatic environment.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schöler, Prof. Dr. Heinz F.
Date of thesis defense: 9. December 2005
Date Deposited: 16. Jan 2006 15:28
Date: 2005
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institut für Geowissenschaften
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Analyse, Abwasser / Wasserverschmutzung, Hormon, Immunoassay
Uncontrolled Keywords: ELISA , Spurenanalytik , EE2 , Affinitätslimit , Optimierungppt , optimization
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