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Transition-Metal Complexes as Enzyme-Like Reagents for Protein Cleavage

Pavlovic Rosman, Dina

German Title: Übergangsmetallkomplexe als Peptidase-Mimetika

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Abstract

In this thesis, metal-promoted hydrolytic cleavage of the amide bond in histidine-containing dipeptides, has been studied. Transition-metal complexes are emerging as new reagents for selective cleavage of unactivated amide bonds in proteins. Such complexes bind to the side chains of methionine and histidine forming an inert complex with the N-terminal amino acid in the peptide. This binding is a prerequisite for subsequent cleavage, which occurs near these “anchoring” residues. We designed transition metal complexes for the cleavage of the first peptide bond downstream from the anchoring side chain of histidine. For this purpose, a series of ligands and their corresponding metal complexes, containing various divalent metal ions, such as Pd(II), Zn(II), Cu(II), Co(II), Ni(II) and Cd(II) have been synthesized. To complete their characterization, beside 1H and 13C NMR data, FAB/ESI-MS data and elemental analysis, crystallographic data of nine complexes have been obtained. They gave further insight into the geometry and nature of binding in synthesized metal complexes. In the course of this thesis, the role of the synthesized transition metal complexes as the promotores in the cleavage of the amide bond in small peptides, was examined. To supress the formation of hydrolytically inactive promoter-substrate complexes, the N-terminus of the dipeptides was protected by the acetylation. The histidine residue was placed either on the N- (AcHisGly) or C-terminus (AcbAlaHis) of the dipeptides. The rate of cleavage was monitored by following the 1H NMR resonances of free glycine. In addition, the possibilities to couple one of the new ligands with NTA (N-nitrilotriacetic acid) moiety, were investigated. In that compound, metal complex of the ligand could act as a peptidase, while the NTA moiety is known as an important and well characterized chelator for the oligo-histidine tag. It could be shown that, in this case, the carbodiimide method and mixed anhydride method are coupling methods of choice. To summerize, in this study a new Pd(II) complex was identified, which showed very good regioselectivity in promoting hydrolytic cleavage of dipeptides. Using this complex, almost 80% of the peptide was cleaved after five days. Our results prove that a scissile bond on the carboxylic side of the anchoring histidine residue is necessary for hydrolysis: when the peptide bond is on the N-terminus of the anchoring histidine residue, no hydrolytic cleavage was observed.

Translation of abstract (German)

Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Metall-katalysierten Hydrolyse von Histidin-haltigen Dipeptiden. In den letzten Jahren sind koordinativ ungesättigte Übergangsmetallkomplexe als neue Reagentien für die selektive Spaltung nicht-aktivierter Amid-Bindungen in Peptiden entwickelt worden. Solche Komplexe binden an die Donorgruppen von Aminosäure-Seitenketten wie Methionin oder Histidin. Dies ist eine Voraussetzung für die nachfolgende Spaltung des Peptidrückrats, welche in der Nähe der Bindungsstelle erfolgt. Wir haben Metallkomplexe für die Hydrolyse der Peptidbindung entwickelt, die sich auf der C-terminalen Seite einer Histidin-Ankergruppe befindet. Es wurde eine Serie von Liganden und ihre Komplexe mit divalenten Übergangsmetallen wir Pd(II), Zn(II), Cu(II), Co(II), Ni(II) und Cd(II) synthetisiert. Alle Verbindungen wurden mit Elementaranalyse, 1H und 13C NMR sowie FAB-/ESI-Massenspektrometrie vollständig charakterisiert. Von neun der Verbindungen konnten zusätzlich Kristalle erhalten werden, die für eine Röntgenstrukturanalyse geeignet waren. Dies erlaubte weitergehende Einblicke in die Geometrie und Bindungsverhältnisse der synthetisierten Verbindungen. Anschließend wurde die Eignung dieser Metallkomplexe als Katalysatoren für die Spaltung der Amidbindung in den Dipeptiden AcHisGly und AcbAlaHis untersucht. Um die Bildung inaktiver Katalysator-Peptid-Komplexe zu unterdrücken, wurde der N-Terminus der Dipeptide durch Acetylierung geschützt. Während AcbAlaHis unter den gewählten Bedingungen stabil war, konnte die Hydrolyserate von AcHisGly NMR-spektroskopisch durch zeitabhängige Messung der Intensität des Signals des freigesetzten Glycins verfolgt werden. Für eine mögliche Anwendung dieser Metallkomplexe als Werkzeuge für die hydrolytische Abspaltung der in der Äffinitätschromatographie von Proteinen häufig verwendeten Oligo-Histidin-Tags wurden Konjugate der synthetisierten Liganden mit NTA (Nitrilotriessigsäure) hergestellt, da NTA-Metallkomplexe an 6xHis-Tags binden. Dabei erwiesen sich die Carbodiimid- und Mixed-Anhydrid-Methode als gut geeignet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte insbesondere ein neuer Palladium(II)-Komplex identifiziert werden, der eine sehr hohe Regioselektivität bei der hydrolytischen Spaltung von Dipeptiden aufweist. Innerhalb von fünf Tagen hydrolysiert diese Verbindung nahezu 80% eines vorgelegten Peptids. Wie erwartet, wird nur die Amidbindung auf der C-terminalen Seite der Histidin-Ankergruppe gespalten. Befindet sich die Peptidbindung auf der N-terminalen Seite des Histidins, so ist keine Hydrolyse zu beobachten.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Prof. Dr. Metzler-Nolte, Nils
Date of thesis defense: 21. December 2005
Date Deposited: 01. Feb 2006 11:42
Date: 2005
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: übergangsmetallkomplexe, peptidase mimetika
Uncontrolled Keywords: transition-metal complexes , artificial peptidase
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