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Abstract

Tiermodelle sind in der pharmazeutischen Forschung eine teure und oftmals ineffiziente Methode, um Sicherheitsrisiken für den Menschen aus den gewonnenen toxikologischen Daten abzuleiten. Daher spielen, besonders in der frühen Phase der Arzneimittelforschung und entwicklung, In vitro-Systeme wie primäre Rattenhepatozyten und die verstärkt aufkom-menden Genomics- und Proteomics-Technologien eine immer bedeutendere Rolle in der toxikologischen Forschung. Ein erstes Ziel dieser Arbeit war, dieses In vitro-System als potentiellen Ersatz für traditionelle In vivo-Experimente zu charakterisieren. Da bereits bekannt war, dass primäre Rattenhepatozyten in Kultur an Aktivität verlieren (z.B. Xenobiotika metabolisierende Enzyme), wurde die Auswirkung der Kulturdauer auf die Genexpression mittels eines Low-Density- und eines High-Density-Microarray-Systems untersucht. Die Analyse der Protein-expression wurde durch 2D-Gelelektrophorese und SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight) durchgeführt. Das zweite Ziel war eine Validierungs-studie des beschriebenen Zellsystems. Hierzu wurden Zellen mit dem bekannten Hepatotoxin Acetaminophen behandelt und dosisabhängige Gen- und Proteinexpressionsveränderungen ermittelt. In der durchgeführten Zeitserie kam es, insbesondere nach 24 h, zu einer deutlichen Repression von wichtigen, in den Xenobiotika-Metabolismus involvierten Phase-I- und Phase-II-Enzymen (z.B. P450-Monooxygenasen, Glutathion-S-Transferasen, Sulfotrans-ferasen) und antioxidativ wirkenden Enzymen (z.B. Katalase, Glutathionperoxidase, Super-oxiddismutase). Bei den induzierten Enzymen handelte es sich vielfach um Akute-Phase-Enzyme (z.B. α-2-Makroglobulin, LPS-Binding-Protein, Ferritin, Serinproteinase-Inhibitor B, Haptoglobin), deren Regulation auf eine Stressantwort durch die Perfusion zurückzuführen war. Parallel dazu kam es durch proliferierende Zelltypen (vorwiegend Fibroblasten und Epithelzellen) und dedifferenzierende Hepatozyten in den Kulturen zu einem Ansteigen der Expression von Strukturgenen (z.B. β-Actin, α-Tubulin, Vimentin). Der In vivo-Effekt eines Enzymwechsels während der Leberperfusion von Collagenase D zu Liberase Blendzyme führte zu signifikanten Veränderungen sowohl in der Gen- als auch der Proteinexpression und konnte durch alle angewandten Technologien detektiert werden. Diese Ergebnisse verdeutlichten das enorme Potential der durchgeführten Genomics- und Proteomics-Methoden. Die Behandlung mit Acetaminophen führte auf der Ebene der Genexpression zu deutlichen Veränderungen. Auf der Proteinexpressionsebene wurde ebenfalls ein Anstieg sowohl an induzierten als auch reprimierten Proteinen nach der Acetaminophen-Dosierung detektiert. Zusätzlich konnte hier ein erwarteter dosisabhängiger Effekt erkannt werden. Überein-stimmende Veränderungen mit der Zeitserie konnten dagegen weder in der Gen- noch in der Proteinexpression festgestellt werden. Die im Zeitverlauf massiv auftretenden Veränderungen in den primären Hepatozyten ohne Behandlung lassen darauf schließen, dass durch Acetaminophen hervorgerufene Effekte zum größten Teil überlagert wurden. Wenngleich es nach nur einer getesteten Substanz verfrüht erscheint abschließende Aussagen über das Zellkultursystem zu machen, können doch einige Rückschlüsse gezogen werden. Zum Einen stimmten die Ergebnisse aus den beiden eingesetzten Microarray-Systemen und der quantitativen Real-Time PCR überein. Dadurch validierten sich die Resultate der analysierten Plattformen gegenseitig. Zum Anderen kam es bei der Mehrzahl der identifi-zierten Proteine ebenfalls zu einer hohen Korrelation zwischen Gen- und Proteinexpression. Hierbei auftretende grundlegende Unterschiede lassen auf posttranskriptionelle Regulations-mechanismen schließen. Als Fazit lässt sich sagen, dass die potentiellen Einsatzmöglichkeiten und Vorteile der getesteten Methoden die Nachteile überwiegen. Allerdings ist es wichtig, diese Methoden nicht in Konkurrenz zueinander, sondern einander ergänzend einzusetzen, um ein möglichst umfassenendes Bild auftretender Zelltoxizität auf molekularer Ebene zu erhalten. Primäre Rattenhepatozyten erscheinen unter den getesteten Kulturbedingungen für Gen- und Protein-expressionsanalysen bis maximal 24 h als sinnvoll. Für mittel- bis langfristige Toxizitäts-studien ist die weitere Entwicklung brauchbarer Zellkultursysteme dringend erforderlich, um ihre Vorteile Schnelligkeit, Kosten und hohe Sensitivität zur Vorhersage möglicher Arznei-mitteltoxizität einzusetzen.

Translation of abstract (English)

The use of animal models in pharmaceutical research is a costly and sometimes inefficient method of generating toxicity data and hence predicting human safety. Therefore, in vitro test systems, such as primary rat hepatocytes and the developing genomics and proteomics technologies are playing an increasingly important role in toxicological research. These are having a greater potential impact in the early phases of drug discovery and development. The primary aim of the study reported here was to characterize an in vitro primary cell system as a potential substitute for traditional in vivo toxicology experiments. It is well known that primary hepatocytes lose function whilst in culture (e.g., drug metabolising enzyme activity). Consequently, the effect of cell culture duration was investigated using both low-density and high-density microarray gene expression systems and proteomics tools, such as 2D-gel electrophoresis and SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation-Time Of Flight). A second major aim was a “proof-of-concept” study using the characterized cell system. For this purpose, analysis of the dose dependent gene and protein expression changes were carried out on cells which were treated with the model hepatotoxicant acetaminophen. In time series experiments, especially after 24 h, a significant down-regulation of many important Phase I- and Phase II-enzymes (e.g., cytochrome P450s, glutathione-S-trans-ferases, sulfotransferases) involved in xenobiotic metabolism, and antioxidative enzymes (e.g., catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase) was observed. Acute-phase-response enzymes were frequently up-regulated (e.g., LPS binding protein, α-2-macro-globulin, ferritin, serine proteinase inhibitor B, haptoglobin), which is likely to be a result of cellular stress caused by the cell isolation procedure (perfusion) itself. A parallel observation was the increased expression of several structural genes (e.g., β-actin, α-tubulin, vimentin), possibly caused by other proliferating cell types in the culture, such as fibroblasts or alternatively by hepatocyte dedifferentiation. The in vivo effect of an enzyme change during the liver perfusion from Collagenase D to Liberase Blendzyme was a significant change in gene and protein expression and could be detected by all applications platforms. This reflects the enormous potential of these genomic and proteomic methods. Acetaminophen treatment was also found to cause significant changes on the gene expression. At the protein level, an increase in the number of up- and down-regulated proteins was also detected after acetaminophen exposure. Additionally, an expected dose-dependent increase in regulated proteins could be seen. No overlapping changes with the time series could be detected, neither at the gene expression nor at the protein expression level. However, it seems that the substantial variations seen in untreated cells through the time series masked many effects caused by acetaminophen, and only a few significantly regulated genes and proteins were observed. Although it is challenging to make definitive deductions on the cell system after only one tested substance, several conclusions can still be drawn. Firstly the methodologies of microarray analysis and quantitative Real-Time PCR concur, which automatically validates results obtained by both platforms. Secondly, the clear correlation between gene and protein expression for the majority of identified proteins suggests that those with significant differences may have posttranscriptional regulation mechanisms. In conclusion, the potential applications and advantages outweigh the disadvantages of the individual methods tested. It is also important to use them in a complementary way, to gain a comprehensive picture of the molecular events occurring during cellular toxicity. Rat primary hepatocytes are a suitable model, under the culture conditions tested here, for gene and protein expression profiling for time points no longer than 24 h. For medium- to long-term toxicology studies beyond this time point, further development of suitable cell culture systems is urgently required to enable the faster, cheaper and more sensitive prediction of potential chronic drug toxicity.