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Solid Phase Synthesis and Biological studies on metal conjugates of bioactive peptides for targeted delivery

Noor, Fozia

German Title: Festphasesynthese und biologische Untersuchungen an Metallkonjugaten zum gezielten Transport biologisch activer Peptide

PDF, English
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Summary Peptide-based drug delivery systems and therapeutics have gained an enormous attention during the last ten years. Progress in this field will lead to site specific delivery, improved receptor affinities, efficient cellular uptake and/or nuclear targeting. Thus, in this research project, metal conjugates of some bioactive peptides were synthesized and biologically tested in order to evaluate the effects of these metal moieties on the biological activities such as the cellular uptake, nuclear targeting and binding affinity, of these selected peptides. In this study, the two redox active metallocenes, ferrocene and cobaltocenium and in addition the cytotoxic platinum were chosen as metal labels. The investigated peptides were the Simian Virus 40 nuclear localisation signal (NLS), the HIV transactivator of transcription (TAT) peptide and the small regulatory peptide, the neurotensin (NT). Metal conjugates of these bioactive peptides were successfully synthesized by solid phase peptide synthesis (SPPS) which was used not only for the covalent bonding of the metallocenes to the peptides but also for the complexation of platinum to the peptides and fluorescence labelling with FITC. Comprehensive characterisation of the synthesized bioconjugates was carried out by various techniques such as NMR, RP-HPLC, MS and electrochemistry. The cellular uptake and nuclear localisation of the metallocene-NLS and -TAT bioconjugates was monitored by fluorescence microscopy in living liver cancer cells (Hep G2). The metallocene-NLS conjugates were efficiently internalized by the cells and were localised in the nuclei of the Hep G2 cells. The metallocene moiety is responsible for the enhanced cellular uptake of these bioconjugates and the NLS transports the organometallic species into the nuclei. This is the first example of the directed nuclear delivery of ferrocene and the cobaltocenium cation, by conjugation to the NLS peptide. The use of the scrambled NLS sequence (NLSscr) abolishes the nuclear targeting property of the conjugates. All metallocene-NLS bioconjugates were found to be non-toxic in concentrations up to 1mM in the WST-1 proliferation assay. In case of the metallocene-TAT bioconjugates, the ferrocene moiety plays a role in the escape of the conjugate from the endosomes, which is an advantage because the utility of TAT peptide as a vector for cellular delivery is limited by its inability to escape from the endosomes. Moreover, these peptides are toxic in higher concentration due to cell membrane perturbation. This was also demonstrated in the present study using the WST-1 proliferation assay. In the last part of the project, metal conjugates of wild type NT(8-13) and the modified Pseudoneurotensin (pNT) were synthesized and tested for their binding affinity to the NTR1 receptors in the HT 29 adenocarcinoma cell line. Replacement of Arg8-Arg9 with Lysines in pNT led to a significant decrease in the binding affinity. The metal-NT bioconjugates showed good receptor affinity especially the cobaltocenium-NT conjugate (IC50=2.3nM). In this case, the lipophilicity of the metallocene bioconjugate may facilitate the crossing of the blood brain barrier which is a limiting factor in any centrally intended therapy. The Pt-NT bioconjugate also showed good affinity (IC50=6.8nM) for the receptors. Thus, such bioconjugates may be specifically and selectively delivered to the tumour tissues that overexpress the neurotensin receptors. In conclusion, the optimised synthesis procedures for the studied metals and the peptides were established. The biological studies demonstrate a great potential of these metals for the improvement of the biological functions of the tested peptides especially for use as vectors for cellular uptake and targeted nuclear delivery. This represents a novel application of bioorganometallic chemistry in biological systems.

Translation of abstract (German)

Zusammenfassung Peptid-basierten Wirkstoff-Transportsystemen und Therapeutika wurde in den letzten zehn Jahren große Aufmerksamkeit gewidmet. Fortschritte auf diesem Gebiet versprechen gezielten Transport, erhöhte Rezeptor-Affinitäten, effiziente zelluläre Aufnahme und/oder Aufnahme in den Zellkern. Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Metallkonjugate einiger biologisch aktiver Peptide synthetisiert und auf ihre biologische Wirksamkeit getestet. Ziel war es, die Effekte der Metall-Struktureinheiten auf die biologische Aktivität wie Aufnahme in die Zelle bzw. den Zellkern sowie die Bindungsaffinität der Peptide zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden die redox-aktiven Metallocene Ferrocen und Cobaltocen sowie das cytotoxische Platin als Metall-Komponenten ausgewählt. Untersuchte Peptide waren das Kernlokalisierungssignal (NLS) des viralen Antigens SV 40 T, das HIV-TAT-Peptid (transactivator of transcpition) und das kleine regulatorische Peptid Neurotensin (NT). Metallkonjugate dieser biologisch aktiven Peptide wurden mit Hilfe der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) erhalten. Diese Methode wurde nicht nur Knüpfung der kovalenten Bindung zwischen Peptid und Metallocen verwendet, sondern auch zur Komplexierung des Platins durch die Peptide und zur Fluoreszenz-Markierung mittels FITC. Die synthetisierten Biokonjugate wurden mit unterschiedlichen Techniken wie NMR, RP-HPLC, MS und elektrochemischen Verfahren umfassend charakterisiert. Die Aufnahme der Metallocen-NLS- und –TAT-Biokonjugate in die Zelle und den Zellkern wurde durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden Leberkrebszellen (Hep G2) verfolgt. Die Metallocen-NLS-Konjugate wurden effizient in die Zellen aufgenommen und waren in den Zellkernen der Hep G2-Zellen lokalisiert. Die Metallocen-Struktureinheit ist verantwortlich für die erhöhte Aufnahme dieser Biokonjugate in die Zelle wohingegen die NLS-Einheit den Transport der organometallischen Spezies in den Zellkern ermöglicht. Dies ist das erste Beispiel eines gezielten Transportes von Ferrocen und des Cobaltocenium-Kations in den Zellkern durch Konjugation mit dem NLS-Peptid. Die Verwendung einer intern vertauschten NLS-Sequenz (NLSscr) unterbindet die zielgerichtete Aufnahme in den Zellkern. Alle NLS-Biokonjugate waren im WST-1 Proliferations-Assay nicht toxisch. Im Fall der Metall-TAT-Biokonjugate spielt die Ferrocen-Einheit eine Rolle beim Verlassen der Endosome durch Konjugate, was insofern vorteilhaft ist, als daß die Wirksamkeit von TAT als Vektor für den zellulären Transport durch seine Unfähigkeit, die Endosomen zu verlassen, eingeschränkt ist. Darüberhinaus sind diese Peptide in höherer Konzentration toxisch aufgrund einer Störung der Struktur der Zellmembran. Auch dies wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe des WST-1 Proliferations-Assay nachgewiesen. Im letzten Teil des Projektes wurden Metall-Konjugate vom Wildtyp NT(8-13) sowie vom modifizierten Pseudoneurotensin (pNT) synthetisiert und bezüglich ihrer Bindungsaffinität zu NTR1-Rezeptoren in der HT 29 Ardenokarzinomzelllinie getestet. Substitution in pNT von Arg8-Arg9 durch Lysine führte zu einer signifikanten Erniedrigung der Bindungsaffinität. Die Metall-NT-Biokonjugate zeigten eine hohe Rezeptoraffinität, insbesondere das Cobaltocenium-NT-Konjugat (IC50=2.3nM). In diesem Fall könnte die Lipophilie der Metallocen-Biokonjugate eine Überwindung der Blut-Hirn-Schranke ermöglichen, die einen limitierenden Faktor in jeder auf das ZNS zielenden Therapie darstellt. Das Pt-NT-Biokonjugat zeigte ebenso eine hohe Affinität (IC50=6.8nM) für die Rezeptoren. Dementsprechend könnten solche Biokonjugate insbesondere und selektiv in Tumorgewebe transportiert werden, in denen Neurotensin-Rezeptoren überexprimiert sind. In dieser Arbeit wurden die optimierte Synthesemethoden für die Konjugate der untersuchten Metalle und Peptide etabliert. Die biologischen Untersuchungen zeigen das große Potential dieser Metalle für die Verbesserung der biologischen Wirkungen der untersuchten Peptide insbesondere für die Verwendung als Vektoren für die zelluläre und die gerichtete Aufnahme in den Zellkern. Dies stellt eine neue Anwendung der Bioorganometallchemie in biologischen Systemen dar.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Metzler-Nolte, Prof. Dr. Nils,
Date of thesis defense: 26 January 2006
Date Deposited: 14 Feb 2006 13:51
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Bioorganometallchemie
Uncontrolled Keywords: Metallpeptidekonjugaten , Zellaufnahme , Kernlokalisierungmetal-peptide conjugates , cellular uptake , nuclear localization
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