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Studies on the optimization of expression and purification & Functional characterization of Class C – GPCRs

Venkata Sai Badireenath, Konkimalla

German Title: Studie zur Optimierung der Expression, Aufreinigung und der funktionellen Charakterisierung von GPCRs der Klasse C

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Abstract

G-protein coupled receptor (GPCRs) is a multigene family consisting of more than 1000 genes. They are the most abundant membrane proteins found on a cell surface and are involved in several signaling pathways. In a cell, the signal is transduced by diverse activating endogenous ligands binding on the extracellular surface. This results in the uncoupling of G-proteins from the cytoplasmic loops, leading to the activation of the second messengers. GPCRs have enormous therapeutic importance due to their involvement in basic physiological processes including sensory perception, neurotransmission, metabolism, hormonal balance, etc. Structural and biochemical data are the pre-requisites for designing the drugs involving GPCRs. The current study was focused on the optimization of expression, purification and functional characterization of class-C GPCRs involved in neurotransmission. The first part of the study was aimed at optimizing the expression and purification of the ligand binding extracellular domain (ECD) of rat metabotropic GABAB1b receptor (GBR1bNT) in the recombinant baculovirus (RBV) and E.coli expression systems. GBR1bNT was modeled based on the crystal structure coordinates of ECD of metabotropic glutamate receptor (mGluR). Depending on this GBR1bNT model, molecular cloning strategies were developed for the expression of GBR1bNT. In both systems, GBR1bNT was well expressed and purified. The second part of the study was aimed at biochemical characterization of a putative cholesterol binding motif (pCBM) in Drosophila metabotropic glutamate receptor (DmGluRA). This pCBM might be involved in regulating the binding of DmGluRA to glutamate with high affinity. During the study, it was inferred that a 12- amino-acid amphipathic peptide containing the pCBM might be crucial for the activity of the receptor. Upon conducting [3H]-glutamate binding and detergent-resistant-membrane (DRM) association studies on different truncation constructs of DmGluRA (1-910 amino acids), the N-terminal construct (1-624 amino acids) containing the ECD with one single pCBM was found to be capable of binding glutamate in high affinity state as observed with the full length DmGluRA. Together this study shows that 1) Using an interdisciplinary approach (computational and experimental strategies) GBR1bNT was efficiently expressed and purified in both E.coli and RBV expression systems and 2) the role of pCBM was studied in DmGluRA receptor regulation.

Translation of abstract (German)

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) gehören zu einer Multigen-Familie mit mehr als 1000 Genen. Sie bilden die größte Gruppe der Membranproteine auf der Zelloberfläche und sind an einer Vielzahl von Signaltransduktions-Wegen beteiligt. In einer Zelle wird ein Signal übertragen, indem aktivierende endogene Liganden extrazellulär an die GPCRs binden. Dies führt zu einer Abspaltung von G-Proteinen von den cytoplasmatischen loops des Rezeptors und damit zur Aktivierung von sekundären Signalmolekülen (second messengers), welche die Signalkaskade fortsetzen. GPCRs sind an grundlegenden physiologischen Prozessen wie sensorische Wahrnehmung, neuronale Signalübertragung, Stoffwechsel oder hormonellem Gleichgewicht beteiligt und spielen somit eine wichtige Rolle bei therapeutischen Ansätzen. Die Aufklärung der Struktur und das Sammeln biochemischer Daten der GPCRs sind Voraussetzung für die Entwicklung von Medikamenten, die diese Prozesse beeinflussen. Der Schwerpunkt dieser Studie lag auf der Optimierung der Expression, Aufreinigung und der funktionellen Charakterisierung von GPCRs der Klasse C welche an der neuronalen Signalübertragung beteiligt sind. Der erste Teil der Studie zielte auf die Optimierung der Expression und Aufreinigung der extrazellulären Ligandenbindungsstelle (extracellular domain, ECD) des (metabotropen) GABAB1B-Rezeptors (Rattus norvegicus) (GBR1bNT) in rekombinanten Baculovirus- (RBV) und E.coli-Expressionssystemen. Basierend auf den Daten der Kristallstruktur der ECD des Glutamatrezeptors mGluR wurde ein Modell für GBR1bNT generiert. Dieses Modell war Grundlage für die Entwicklung molekularer Klonierungsstrategien für die Expression von GBR1bNT. In beiden Systemen konnte GBR1bNT gut exprimiert und aufgereinigt werden. Der zweite Teil der Studie befasste sich mit der funktionellen Charakterisierung eines putativen Cholesterin-Bindemotivs (putative cholesterol binding motif, pCBM) des Drosophila Glutamat-Rezeptors DmGluRA. Dieses Bindemotiv scheint an der Regulation der Bindung zwischen DmGluRA und Glutamat beteiligt zu sein. Während der Studie konnte ein 12 Aminosäure langes, amphipatisches Peptid identifiziert werden, welches das pCBM enthält und eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des Rezeptors zu spielen scheint. Basierend auf Studien über [3H]-Glutamat-Bindung und Detergenz-resistente Membranassoziation (DRM) für verschiedene verkürzte Formen des DmGluRA (1-910 Aminosäuren) fand man heraus, dass die N-terminale Form (1-624 Aminosäuren), welche die ECD und ein einziges pCBM enthält, mit hoher Affinität an Glutamat binden kann so wie dies auch bei der vollständigen Form des DmGluRA der Fall ist. Fazit: 1) Unter Anwendung interdisziplinärer Ansätze (sowohl bioinformatische als auch experimentelle Ansätze) konnte GBR1bNT effizient in E.coli und RBV-Expressionssystemen exprimiert und aufgereinigt werden. 2) Die Rolle von pCBM bei der Regulation des DmGluRA-Rezeptors wurde untersucht.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Prof. Dr. Sinning, Irmgard
Date of thesis defense: 10. February 2006
Date Deposited: 15. Feb 2006 15:57
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
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