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Molecular and Functional Analyses of Transport Proteins for Organic Anions

Reichel, Valeska

German Title: Molekulare und funktionelle Charakterisierung von Transportproteinen für Organische Anionen

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Abstract

The blood-cerebrospinal fluid (CSF)-barrier (CSFB) is formed by the Choroid Plexūs (CP). Together with the blood brain barrier it represents an important barrier between brain and circulating blood. Since it can only be passed by small, lipid-soluble and uncharged molecules it is of particular interest to study active transport processes for charged substances across this tissue, especially because many drugs are substrates for these transport proteins. Transporters in the CP are similar to those in the kidney. Therefore, I performed comparative experiments with model organic anions in isolated proximal kidney tubules of killfish and CP of rat and spiny dogfish shark. ·First, I studied transport of the fluorescent cAMP analog fluo-cAMP. Inhibition studies indicate transport mediated by the export proteins Mrp2 and Mrp4. In contrast to transport of the Mrp2-substrate fluorescein-methotrexate (FL-MTX), transport is not regulated by proteinkinase (PK) A, and PKC. For better characterization of kinetic parameters I studied transport of fluo-cAMP in membrane vesicles of MRP2 and MRP4 overexpressing cells. Both MRPs transported fluo-cAMP with similar affinites. Different from results obtained from experiments using renal proximale tubules, fluo-cAMP transport in CP seems not to be mediated by Mrp4, whereas a participation of Mrp1 is likely. Regulation of fluo-cAMP transport in rat CP is not mediated by PKA, PKC or mitogen activated PK (MAPK). ·Transport of Texas Red (TR) and FL-MTX was studied in CP of rat and spiny dogfish shark. Transport of TR across rat CP is a two-step mechanism, which is metabolism-driven, Na+-dependent, potential independent and also independent from Mrp1, Mrp2 and Mrp4. In dogfish shark CP TR transport is Na+-independent, with apical uptake apparently mediated by an Oat-protein, whereas basolateral efflux seems to be mediated by Oatp2 and Mrp1. ·Apical uptake of FL-MTX in rat CP is also Na+-independent with an potential independent basolateral efflux, which is presumably mediated via Mrp1 and Oatp2. Activation of PKA results in an activation of FL-MTX efflux. In dogfish shark FL-MTX is transported via the same transport proteins. But in contrast to rat CP, activation of PKA results in a reduced efflux of FL-MTX, whereas activation of PKC leads to a downregulation of FL-MTX transport.

Translation of abstract (German)

Die Blut-Cerebrospinalflüssigkeit (CSF)-Schranke (BCSFS), wird von den Choroid Plexus (CP) gebildet und stellt zusammen mit der Blut-Hirn-Schranke eine wichtige Barriere zwischen Blut und Gehirn dar. Da die BCSFS nur für kleine, lipidlösliche und ungeladene Moleküle durchlässig ist, ist es von besonderem Interesse, aktive Transportprozesse für geladene Substanzen in diesem Gewebe zu untersuchen, da viele ZNS-Wirkstoffe und Wirkstoffkandidaten Substrate aktiver Transportproproteine sind. Transportprozesse im CP ähneln denen im proximalen Tubulus der Niere. Deshalb wurden vergleichende Experimente mit verschiedenen Modell-Anionen mit isoliertem proximalen Nierentubulus des Killifisch und mit CP von Ratte und Dornhai durchgeführt. ·Zunächst wurde der Transport des fluoreszierenden cAMP-Analogons fluo-cAMP untersucht: Inhibitorstudien legen den Transport von fluo-cAMP durch die Exportproteine Mrp2 und Mrp4 nahe. Im Gegensatz zum Transport des Mrp2-Substrates Fluorescein-Methotrexat (FL-MTX) wird der Transport in der Niere nicht durch die Proteinkinasen A (PK) A und C (PKC) reguliert. Zur besseren Charakterisierung der kinetischen Parameter wurde der Transport von fluo-cAMP in Membranvesikeln aus MRP2 bzw. MRP4 überexprimierenden Zellen untersucht. Beide MRPs transportieren fluo-cAMP mit gleich hoher Affinität. Anders als in der Niere scheint Mrp4 im CP nicht am Transport von fluo-cAMP beteiligt zu sein, allerdings geben Inhibitionsexperimente mit konkurrierenden selektiven Substraten Hinweise für eine Beteiligung von Mrp1. Die Regulation des Transportes von fluo-cAMP im Ratten-CP erfolgt nicht über PKA, PKC oder die Mitogen-aktivierte PK (MAPK). ·Der Transport von Texas Red (TR) und FL-MTX wurde im CP der Ratte und des Dornhais untersucht. TR wird durch Ratten-CPs in einem zweistufigen Prozess transportiert, der Metabolismus-getrieben, Na+-abhängig, potentialunabhängig und auch unabhängig von Mrp1, Mrp2 und Mrp4 ist. Im Hai ist der Transport von TR Na+-unabhängig, wobei die Aufnahme über ein Oat-Protein zu erfolgen scheint, während der basolaterale Efflux mutmasslich über das Oatp2-Protein und Mrp1 erfolgt. ·Die apikale Aufnahme von FL-MTX im Ratten-CP ist ebenfalls Na+-abhängig, der basolaterale Efflux ist potentialunabhängig und erfolgt wahrscheinlich auch über Mrp1 und Oatp2. PKA-Aktivierung führt zu einer Aktivierung des FL-MTX Effluxes. Im Dornhai wird FL-MTX durch die gleichen Transportproteine transportiert. Im Gegensatz zur Ratte führt eine PKA-Aktivierung zu einem reduzierten Efflux von FL-MTX, während PKC-Aktivierung zu einer Herabregulierung des Transports von FL-MTX führte.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Fricker, Prof. Dr. Gert
Date of thesis defense: 13 February 2006
Date Deposited: 17 Feb 2006 13:55
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Plexus chorioideus, Blut-Liquor-Schranke, ABC-Transporter
Uncontrolled Keywords: Organische AnionentransporterBlood-Cerebrospinal Fluid Barrier , Organic Anion Transport
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