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Identifizierung und Charakterisierung viraler und zellulärer Komponenten, die an den frühen Schritten der HBV-Infektion beteiligt sind

Engelke, Matthias

German Title: Identifizierung und Charakterisierung viraler und zellulärer Komponenten, die an den frühen Schritten der HBV-Infektion beteiligt sind

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PDF, German
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Abstract

Das humane Hepatitis B Virus (HBV) zeichnet sich durch eine enge Wirtsspezifität und einen ausgeprägten Lebertropismus aus. Diese Eigenschaften werden überwiegend von den frühen Schritten der Infektion bestimmt. So produzieren Maushepatozyten mit stabil integriertem HBV-Genom zwar infektiöse Viren, können selber aber nicht infiziert werden. Das Fehlen eines infizierbaren Zellkultursystems war lange Zeit limitierend für die Erforschung der frühen Infektionsschritte. Die zellulären Rezeptoren, die an der HBV-Aufnahme oder der Membranfusion beteiligt sind, konnten bislang noch nicht identifiziert werden. Erst die Entdeckung, dass die differenzierbare Hepatomzelllinie HepaRG mit HBV infiziert werden kann (Gripon et al., 2002), ermöglicht es, den Aufnahmemechanismus von HBV zu untersuchen. In Infektionskompetitionsversuchen können nun virale und zelluläre Proteine auf ihre Beteiligung an den frühen Schritten der Infektion getestet werden. In Experimenten mit rekombinant hergestellten HBV-Partikeln zeigten Le Seyec et al., dass Deletionen von 5 Aminosäuren innerhalb der ersten 77 Aminosäuren der preS1-Domäne des L-Oberflächenproteins zum Verlust der Infektiosität führten. Durch Infektions-kompetitionsversuche konnte ein inhibitorisch aktives, synthetisches Peptid identifiziert werden, das nur die Aminosäuren 2 bis 48 umfasst und an Glycin-2 myristoyliert ist (Gripon et al., 2005). Neben der Etablierung von biochemischen Methoden zur Identifizierung des zellulären HBV-Rezeptors, war es das Ziel dieser Arbeit, diejenigen Aminosäuren zu bestimmen, die für die inhibitorische Aktivität des HBVpreS/2-48myr-Peptids verantwortlich sind. Hierfür wurde ein E. coli-Expressionsystem etabliert, das die Herstellung von rekombinanten HBVpreS-GST-Fusionsproteinen mit Deletions- und Punktmutationen erlaubt. Durch die Coexpression der Hefe-N-Myristoyltransferase (NMT) konnte eine in vivo Myristoylierung der Fusionsproteine erreicht werden. Das HBVpreS-GST-Fusionsprotein inhibierte die Infektion bei nanomolaren Konzentrationen. Es besitzt daher eine vergleichbare Aktivität wie das synthetische HBVpreS/2-48myr-Peptid. Die Bestimmung der HBV-Infektionsinhibitionsaktivität von verschiedenen preS-Fusionsproteinmutanten zeigte, dass Deletionen innerhalb der Aminosäuren 21 bis 48 zwar Einfluss auf die Aktivität des Peptids haben, aber nicht zu einer vollständigen Inaktivierung führen. Deletionen innerhalb der Aminosäuren 11 bis 21 dagegen führten zum vollständigen Verlust der Inhibitionsaktivität. Innerhalb dieses Bereichs konnten drei hochkonservierte Aminosäuren identifiziert werden (Aminosäuren 11, 12 und 13), die für die Inhibitionsaktivität von HBVpreS/2-48myr unersetzlich sind. Der Austausch nur einer dieser Aminosäuren führte zum vollständigen Verlust der Inhibitionsaktivität. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Resistenzentwicklung gegen das antivirale HBVpreS/2-48myr-Peptid über die Variation dieser essentiellen Aminosäuren unwahrscheinlich ist und dass das Peptid einen sensiblen frühen Schritt des viralen Lebenszyklus hemmt. Acylierte preS1-Peptide stellen somit eine neue, rekombinant herstellbare Klasse von HBV-Aufnahmeinhibitoren dar, die in der Behandlung einer akuten und möglicherweise auch einer chronischen Hepatitis B zum Einsatz kommen könnten.

Translation of abstract (English)

The human Hepatitis B Virus (HBV) is characterized by a narrow host range and a strict liver tropism. These traits seem to be determined predominantly by the early infection events. Mouse hepatocytes with a stably integrated HBV genome can produce Dane particles, although the cells themselves are not infectable. Insights into early infection events have been hampered by the lack of an infectable cell culture system. To date no cellular receptor mediating HBV uptake or viral membrane fusion with the cellular membranes could be identified. Meanwhile the human hepatoma cell line HepaRG can be rendered susceptible by the experimental induction of a differentiated state thereby allowing the analysis of early infection events (Gripon et al., 2002). In an infection competition assay, viral and cellular proteins now can be tested for their involvement in early infection processes. Le Seyec et al. demonstrated that HBV particles lose their infectivity by the introduction of five amino acid deletions within the first 77 preS1 amino acids of the L surface protein. Infection competition studies led to the identification of a synthetic peptide inhibitor comprising the preS1 amino acids 2-48 and being myristoylated at glycine 2 (HBVpreS/2-48myr, Gripon et al., 2005). Besides the establishment of biochemical methods for the identification of a cellular HBV receptor, the aim of this study was to determine the amino acids responsible for the inhibitory activity of the HBVpreS/2-48myr peptide. Therefore an E. coli expression system was established that permits the production of recombinant HBVpreS-GST fusion proteins with deletion- and point-mutations. The in vivo myristoylation of the fusion proteins could be achieved by coexpressing the yeast N-myristoyltransferase (NMT). Comparable to the activity of the synthetic HBVpreS/2-48myr peptide, the HBVpreS-GST fusion protein was active even at nanomolar concentrations. The evaluation of the infection inhibition activity of fusion protein mutants revealed that deletions within the amino acids 21-48 have an influence on the activity but are not sufficient to abrogate the activity of the peptide. Nevertheless, deletions within amino acids 11-21 lead to a complete loss of the inhibitory activity. Within this sequence, three highly conserved amino acids could be identified (amino acid 11, 12 and 13) which are essential for the inhibitory activity of HBVpreS/2-48myr. The exchange of just one of these amino acids resulted in a complete loss of the HBVpreS/2-48myr peptides ability to inhibit HBV infection. These results suggest that the development of resistance against the antiviral peptide HBVpreS/2-48myr via variation of these essential amino acids is unlikely. The peptide inhibits a vital and early step in the viral life cycle. Therefore, acylated preS1 peptides represent a novel class of HBV entry inhibitors, that are easy to produce in a recombinant expression system and that might be effective in the treatment of an acute and/or chronic hepatitis B infection.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. Stephan Urban, PD
Date of thesis defense: 23. February 2006
Date Deposited: 16. Mar 2006 10:46
Date: 2005
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Hygiene-Institut
Subjects: 610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Hepatitis-B-Virus, Inhibitor, Myristoylierung, Rezeptor
Uncontrolled Keywords: preS1 , HepaRG , HBV-Rezeptor , HBVpreS/2-48myrHBV entry inhibitor , HBV infection inhibition , myristoylated preS peptides , HepaRG cell line
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